Metode de laborator de cercetare. proteinurie

Studii de laborator:: Video Hematologie

conținut

Studii de laborator:: video hematologie
Renală (adevărat) proteinurie
Extrarenale (fals) proteinurie
Determinarea proteinelor în urină
Determinarea proteinurie de zi cu zi
K = (x·-v) / 1000
Proteinurie selectivă
&beta-2-microglobulina
Sânge și urină molecule medii
Neplazmennye (tesut) uroproteiny
Studiul enzimelor în sânge și urină
Proteina bence-jones

Cantități mici de proteine se gasesc in urina de zi cu zi de la persoane sanatoase. Cu toate acestea, astfel de concentrații scăzute nu poate fi detectată prin metode de cercetare convenționale. Izolarea cantități mai mari de proteină pentru care testele calitative conventionale pentru proteine in urina devin pozitive, denumite proteinuriei. Distinge renală (adevărat) și extrarenale proteinurie (fals). In proteinurie renale proteine in urina penetrează direct din sânge din cauza creșterii de filtrare sau de reducere a glomerulilor rinichiului reabsorbția tubulară acestuia.

Renală (adevărat) proteinurie

Renală (adevărat) proteinurie este funcțională și organică. cel mai adesea observate după speciile sale între proteinurie renală funcțională:

- sugari proteinurie fiziologice care dispare la 4 până la 10 zile după naștere, și mai târziu prematura;
- albuminurie ortostatică, ceea ce este tipic pentru copiii cu vârste cuprinse între 7-18 ani și apare numai în poziția verticală a corpului;
- tranzitorie (accident vascular cerebral) albuminuria, care poate fi cauza diferitelor boli ale organelor digestive, anemie severă, arsuri, leziuni sau factori fiziologici de exerciții grele, hipotermie, emoții puternice, alimente abundente, bogate în proteine și altele.

Organic (renale) proteinuria se observă datorită trecerii proteinei din fluxul sanguin prin bolile glomerulare renale endoteliale porțiuni deteriorate (glomerulonefrite, nefroză, nefroscleroza, amiloidoza, nefropatia gravidă), tulburări ale hemodinamicii renale (hipertensiune venoasă renală, hipoxie), trofice și toxice (inclusiv inclusiv medicamente) efectele asupra capilarelor glomerulare pereții.

Extrarenale (fals) proteinurie

Extrarenale (false) proteinuria în care sursa de proteine in urina este un amestec de leucocite, eritrocite, bacterii, celule uroteliale. observate în timpul bolilor urologice (urolitiazei, tuberculoza renala, rinichi si tumori ale tractului urinar, etc.).

Determinarea proteinelor în urină

Cele mai multe dintre metodele calitative și cantitative pentru determinarea proteinelor în urină, pe baza de coagulare în volum de urină sau la interfața (și urină acidă).

Metode calitative suplimentare pentru determinarea în bedka urină de testare mai larg standardizate cu acid sulfosalicilic și un Geller eșantion inelar.

test standardizat cu acid sulfasalitsilovoy se desfășoară după cum urmează. Cele două tuburi se toarnă în 3 ml de urină filtrată. Unul dintre ei a fost adăugat 6-8 picături de soluție 20% acid sulfasalitsilovoy. Pe un fundal întunecat sunt comparate ambele tuburi. Opacifierea urină în tubul cu acid sulfasalitsilovoy indică prezența proteinei. Inainte este studiul necesar pentru a determina reacția urinei, iar dacă este alcalină, apoi se acidulează cu 2-3 picături de soluție 10% acid acetic.

proba Geller bazat pe faptul că prezența proteinelor în urină la interfața de acid azotic și coagularea urinei apare si apare inel alb. În eprubetă se toarnă 2,1 ml de soluție de acid azotic 30% și delicat stratificat pe peretele tubului este exact aceeași cantitate de urină filtrată. Aspectul inelului alb la limita a două fluide indică prezența proteinelor în urină. Trebuie amintit că inelul uneori alb este format cu un număr mare de urați, dar spre deosebire de proteine apare inel ușor deasupra limitei dintre cele două fluide și dizolvate sub încălzire [Pletnev NG 1987].

Dintre metode cantitative sunt cel mai frecvent utilizate:

1) Metoda unificată Brandberg-Roberts-Stolnikova, bazându-se pe eșantionul inelar Geller;
2) Metoda fotoelektrokolorimetrichesky de determinare cantitativă a proteinelor în urină opacității formate la acidul sulfasalitsilovoy plus;
3) Testul de biuret.

Identificarea proteinelor în urină metoda accelerată simplificată este realizată printr-o metodă colorimetrică folosind hârtie indicatoare, care este fabricat de «Lachema» (Slovacia), «Albuphan», «Ames» (Anglia), «Albustix», «Boehringer» (Germania), «Comburtest» și altele. metoda este imersat în urină benzi de hârtie specială tetrabromfenolovym impregnat tampon albastru și citrat, care își schimbă culoarea de la galben la albastru, în funcție de conținutul de proteine în urină. Concentrația de proteină aproximativă în urină de test a fost determinată prin scală standard. Pentru a obține rezultate corecte, trebuie să fie îndeplinite următoarele condiții. pH-ul urinar trebuie să fie în 3,0-3,5- la urina prea alcalin (pH 6,5) rezultate fals pozitive vor fi obținute, iar atunci când urina prea acid (pH 3,0) - fals negative.

Hârtia trebuie să fie în contact cu nu mai mult decât este specificat în instrucțiunile de urină investigate, în caz contrar, testul va da o reacție fals pozitivă. Aceasta din urmă este de asemenea observată atunci când conținutul în urină de cantități mari de mucus. Sensibilitatea diferitelor tipuri de hârtie și de serie pot fi diferite, astfel încât o evaluare cantitativă a proteinelor în urină prin această metodă trebuie să fie tratate cu prudență. Determinarea valorii sale în urină, zilnic, folosind hârtie de testare nu poate [Pletnev NG 1987]

Determinarea proteinurie de zi cu zi

Există mai multe modalități de a determina cantitatea de proteină eliberată în urină pe zi. Cea mai simplă metodă este Brandberg -Robertsa-Stolnikova.

Metodologie. 5-10 ml de urină pe zi complet agitat turnat în tub și pereții acestuia adăugat cu atenție soluție 30% acid azotic. În prezența proteinelor în urină într-o cantitate de 0,033% (adică 33 mg per 1 litru de urină) în 2-3 minute apare inel alb subtil, dar în mod clar vizibil. La o probă negativă concentrație mai mică. La un conținut mai ridicat de proteine în urină este determinată de cantitatea de urină diluții cu apă distilată repetată până până ce formează nici un inel. Tubul final în care inelul este încă vizibil, concentrația proteinei va fi 0.033%. 0.033 înmulțirea gradului de diluție urină, conținutul de proteină este determinat în 1 l de urină nediluat în grame. Apoi, conținutul de proteine calculat în urină zilnică conform formulei:

K = (x·-V) / 1000

unde K - cantitatea de proteine in urina zilnic (g) - x - cantitatea de proteină în 1 litru de urină (g) - V - cantitatea de urină pe zi alocate (ml).

În mod normal, în timpul zilei urina este eliberat de 27 la 150 mg (medie 40-80 mg) de proteină.

Acest test permite determinarea proteinelor numai o urină fină (albumina). metode cantitative mai precise (metoda colorimetrică Kjeldahl și colab.) sunt destul de complicate și necesită un echipament special.

În proteinurie renală în urină albumina iasă în evidență, nu numai, dar și alte tipuri de proteine. proteinogramma Normal are următorul procentaj (Prin Seitz, et al, 1953.): albumine - 20%, &alfa-₁-Globulina - 12% &alfa-₂-Globulina - 17% &gamma - globulină - 43% &beta - globuline - 8%. Raportul dintre albumine la globulinele variază în diferite boli de rinichi, adică raportul cantitativ deranjate între fracțiunile proteice.

Cele mai comune metode de fracționare uroproteinov sunt următoarele: sărare săruri neutre, fracționare electroforetică, metode imunologice (o reacție în funcție de imunodifuzie radială Mancini, testul imunoelectroforeza, imunoelectroforeza pretsipitatsionny), cromatografie de filtrare pe gel și ultracentrifugare.

Introducerea uroproteinov metode de fracționare bazate pe studiul mobilității electroforetice, variabilitatea greutății moleculare, mărimea și forma moleculelor uroproteinov, este posibil să se aloce specifice unui anumit studiu tipuri de boli proteinuria proteinele plasmatice individuale Distanțe. Sunt identificate în prezent în urină de mai mult de 40 de proteine plasmatice, inclusiv proteinele plasmatice în urină normală 31 [Berggard, 1970].

proteinurie selectivă

În ultimii ani, conceptul de selectivitate proteinuriei. In 1955, Hardwicke și Squire au formulat conceptul de proteinurie „selectiv“ și „non-selective“, determinarea faptului că filtrarea proteinelor plasmatice în urină este supusă unui anumit model: mai mare greutatea moleculară a proteinei excretat în urină, clearance-ul mai puțin sol și concentrația mai mică în urină finală. Proteinuria corespunzătoare acestui model este selectiv, în contrast cu non-selective, ceea ce este caracteristic pentru modelele de distorsiune derivate.

Detectarea proteinelor în urină, cu o greutate moleculară relativ ridicată arată o lipsă de selectivitate filtru renal și-a exprimat înfrângerea. În aceste cazuri, vorbim de selectivitate scăzută a proteinuriei. Prin urmare, în prezent pe scară largă care determină fracțiuni proteice de urină folosind tehnici de electroforeză în amidon și poliacrilamidă electroforeză în gel. Rezultatele acestor metode de cercetare pot fi evaluate pe selectivitatea proteinurie.

V.S.Mahlinoy Potrivit (1975), cel mai justificat este de a determina selectivitatea proteinuriei prin compararea autorizările 6-7 proteinele plasmatice din sânge individuale (albumina, traneferrina, &alfa-₂ - macroglobulina, IgA, IgG, IgM) utilizând reacție precisă și specifică imunoteste cantitativă radial imunodifuzia conform cu Mancini și imunoelectroforeza testul imunoelectroforeza pretsipitalnogo. Gradul de selectivitate este determinată prin indicele de selectivitate a proteinuriei, reprezentând raportul dintre referință și proteinele comparate (albumina).

Studiere clearance ale proteinelor plasmatice individuale permite obținerea unor informații fiabile cu privire la starea membranelor filtrare subsolul glomeruli de rinichi. Legătura dintre natura proteinelor excretate în urină și modificări ale membranelor bazale glomerulare și este exprimată ca o constantă, care uroproteinogramme poate judeca indirect modificările fiziopatologice în glomerulii renali. In mod normal, dimensiunea medie a porilor membranei bazale glomerulare este 2,9-4 ° NM O care poate sări peste proteine care are o greutate moleculară de până la 10⁴ (Mioglobulin, acru &alfa-₁ - glicoproteină, lanțuri ușoare de imunoglobulină, Fc și Fab - fragmente de IgG, albumină și transferină).

Glomerulonefrita, dimensiuni ale porilor sindromul nefrotic crescând în membranele bazale glomerulare, și, prin urmare, membrana bazală devine permeabila la moleculele de proteine de dimensiuni mari și de masă (ceruloplasmina, haptoglobina, IgG, IgA, și alții.). Leziuni glomerulare renale extreme în urină apar proteinele plasmatice molecule de sânge gigant (&alfa-₂-macroglobulina, IgM și &beta-₂-lipoprotein).

Definirea spectru de proteine urina, se poate concluziona că o leziune primară a anumitor părți ale nefronului. Pentru glomerulonefrită, care afecteaza in principal membranele bazale glomerulare caracterizate prin prezența în urină a proteinelor de mărime mijlocie și. Pentru pielonefrită, care afecteaza in principal membranei bazale a tubulilor caracteristice absenta krupnomolekulyarnyh și prezența unor cantități crescute de proteine cu greutate moleculară medie și joasă.

&beta-₂-microglobulina

In plus fata de proteine bine cunoscute, cum ar fi albumina, imunoglobulinele, lipoproteine. fibrinogen, transferina, urina conține proteinele plasmatice, inclusiv mikroproteiny interes clinic &beta-₂-microglobulina deschis Berggard și Bearn în 1968. Având o greutate moleculară mică (masă moleculară relativă de 1800), trece liber prin glomerulul renal și aproape complet resorbit în tubul proximal. Aceasta permite utilizarea unei definiții cantitative &beta-₂-microglobulina în sânge sau urină pentru a determina rata de filtrare glomerulară și capacitatea de resorbție renale pentru proteine în tubulii proximali.

Concentrația proteinei în plasmă și urină a fost determinat prin radioimunoanaliză folosind un set standard de «Phade-bas &beta-₂-mikroiest »(Compania "Pharmasia", Suedia). La indivizii sănătoși serul conține, în medie, de 1,7 mg / l (interval de 0.6-3 mg / litru) în urină - medie 81 mg / l (maximum 250 mg / l) &beta-₂-microglobulină. Excesul de urină în lucrarea sa peste 1000 ug / l - fenomen patologic. conținut &beta-₂-microglobulina in sange creste in boli asociate cu rata afectata de filtrare glomerulară, în special în glomerulonefrita acută și cronică, boala rinichiului polichistic, nefroscleroza, nefropatia diabetică, insuficiență renală acută.

concentrare &beta-₂-microglobulinei în urină este crescută în boli asociate cu alterarea funcției reabsorbtsionnoy tubilor, ceea ce duce la o creștere a excreției în urină în 10-50 de ori mai, în special în pielonefrita, insuficiență renală cronică, purulent intoxicație și colab. Caracteristic, cistita, spre deosebire nu pielonefrită creșterea observată a concentrației &beta-₂-microglobulinei în urină, care poate fi utilizat pentru diagnosticul diferențial al acestor boli. Cu toate acestea, atunci când interpretarea rezultatelor studiului ar trebui să fie luate în considerare faptul că orice creștere a temperaturii este întotdeauna însoțită de o creștere a excreției &beta-₂-microglobulinei în urină.

sânge și urină molecule medii

moleculă medie (SM), altfel numite toxine proteice sunt substanțe cu greutate moleculară de 500-5000 daltoni. Structura lor fizică este necunoscută. Structura CM este compus din cel puțin 30 de peptide: oxitocina, vasopresina, angiotensina, glucagon, hormon adrenocorticotrop (ACTH), etc. Acumularea excesivă a CM se observă o scădere a funcției renale și a conținutului în sângele unui număr mare de proteine deformate și metaboliții lor .. Ei au o activitate biologică diversă și neurotoxicitatea cauză secundară imunosupresie, anemie secundară, inhibă biosintezei proteinelor eritropoieza și inhibă activitatea multor enzime care perturbă faza inflamației.

nivelul SM în sânge și urină de screening test se determină, de asemenea, prin spectrofotometrie în domeniul ultraviolet lungime de undă de 254 și 280 mm spectrofotometru CI-8B și spectrofotometrică dinamic cu procesare computerizată în gama de lungimi de undă 220-335 nm în aceeași companie Beckman spectrometru . În timpul normal de a primi conținut CM sânge egal cu 0,24 ± 0,02 usl. unități, cât și în urină. - 0,312 ± 0,09 conv. u
Ca o viață produs normal al organismului, acestea sunt eliminate din nighttime normal prin filtrare glomerulară la 0,5% - 5% din utilizata de o alta. Toate fracțiunile SM expuse reabsorbția tubulară.

Neplazmennye (tesut) uroproteiny

Pe langa proteinele plasmatice din sânge, în urină pot fi neplazmennye (tesut) proteine. Potrivit Buxbaum și Franklin (1970), proteinele neplazmennye constituie aproximativ 2/3 din toate urină și biocolloids uroproteinov parte semnificativă la proteinuria patologică. Proteinele de țesuturi cad direct în urina de la rinichi sau de organe sunt anatomic asociate tractului urinar, sau cad de celelalte organe și țesuturi în sânge, și de acolo prin membranele bazale glomerulare renale - in urina. În acest ultim caz, excreția proteinei în țesuturi de urină se produce în mod analog cu proteinele plasmatice diferite greutăți moleculare. Compozitie neplazmennyh uroproteinov extrem de diversă. Printre acestea, glicoproteine, hormoni, antigene, enzime (enzime).

Proteinele de țesuturi detectate în urină folosind metode convenționale ale chimiei proteinelor (ultracentrifugare, cromatografia pe gel, electroforeză, diferite forme de realizare), reacțiile la enzime și hormoni specifici și metode imunologice. Acesta din urmă permite, de asemenea, pentru a determina concentrația uroproteina neplazmennogo în urină și, în unele cazuri, pentru a identifica structurile de țesuturi, care au devenit sursa de aspectul său. Metoda de bază pentru detectarea proteinelor in urina este analiza imunodifuzia neplazmennogo cu antiseruri obținute prin imunizarea animalelor experimentale și urina umană drenată (adsorbit) într-un proteinele plasmatice ulterioare.

Studiul enzimelor în sânge și urină

Când procesul bolii observate celule profunde leziuni vitale, însoțită de eliberarea enzimelor intracelulare în mediul fluid al corpului. Enzimodiagnostika se bazează pe definirea unui număr de enzime izolate din celule ale organelor afectate și nu sunt specifice ser.
Cercetare oameni nefronilor și animale au arătat că unele dintre părțile sale au o diferențiere enzimatică ridicată, strâns legată de funcțiile îndeplinite de fiecare departament. In glomeruli de rinichi conține un număr relativ mic de enzime diferite.

Celulele tubilor renale, în special proximal conține numărul maxim de enzime. Activitatea lor ridicată se observă în bucla de Henle, tubuli drepte și conducte colectoare. Modificări în activitatea anumitor enzime în diverse boli renale depind de procesul de natura, gravitatea și localizare. Ele sunt observate înainte de modificările morfologice în rinichi. Deoarece conținutul diferitelor enzime clar localizate în nefronilor, definiția unei anumite enzime in urina poate contribui la diagnosticul local al procesului patologic în rinichi (glomeruli, tubuli, corticală și medulla), diagnosticul diferential al bolilor renale și pentru a determina dinamica (amortizoarelor și exacerbării) procesul în renal parenchimului.

diagnostic diferențial Durata boli ale sistemului urogenital este utilizat pentru a determina activitatea in sange si urina următoarele enzime: lactat dehidrogenază (LDH), aminopeptidaza leucină (LAP), fosfatază acidă (AP), fosfatază alcalină (ALP), &beta -. glucuronidază, glutamic-oxaloacetică (GSCHT), aldolază etc. Activitatea transamidinase enzimatică în ser și urină a fost determinat prin biochimice, spectrofotometrice, cromatografice, fluorimetric și metode chimioluminiscente.

Enzimuriya în boala renală este mai pronunțată și natural, decât enzimemiya. Este deosebit de puternic exprimată în faza acută a bolii (pielonefrite acute, traumatisme, dezintegrarea tumorii, infarctul de rinichi, etc.). In aceste boli detectate transamidinase activitate ridicată, LDH, fosfataza alcalină și KF, hialuronidaza, LAP și enzime nespecifice, cum ar fi GSCHT, catalaza [Polyantseva LR 1972].

Localizarea selectiva a enzimelor in nefronilor la detectarea LAP și fosfatazei alcaline în urină se poate spune cu încredere bolilor acute și cronice renale (insuficiență renală acută, necroză tubulară renală, glomerulonefrită cronică) [Shemetov VD 1968]. Potrivit A.A.Karelina și L.R.Polyantsevoy (1965) transamidinase conține doar două corpuri - rinichi și pancreas. Este o enzimă mitocondrială și rinichi în sânge și urină normală absentă. In diferite boli de rinichi transamidinase apare în sânge și urină, iar în leziunile pancreatice - numai in sange.

testul Differential în diagnosticul glomerulonefritei și pielonefrita Krotkiewski (1963) consideră că activitatea fosfatazei alcaline în urină, o creștere care este mai tipic pentru pielonefrita și glomeruloscleroza diabetică decât pentru nefrita acută și cronică. Creșterea dinamicii amilazemiya în timp ce reducerea amylasuria poate indica nefroscleroza și cicatrici renale, LAP are cea mai mare valoare în modificări patologice în glomeruli și tubilor complicate ale rinichilor, deoarece concentrația sa în aceste regiuni ale nefronului superior [Shepotinovsky VP și colab., 1980]. definiție recomandată pentru diagnosticarea nefrita lupus &beta - glucuronidazei si CF [Privalenko MN și colab., 1974].

În evaluarea enzimurii rol în diagnosticul bolilor renale ar trebui să ia în considerare următoarele dispoziții. Enzime, proteine fiind în mod inerent cu greutate moleculară mică pot trece prin glomeruli intact, definind un enzimuriyu fiziologic așa-numitul. Printre aceste enzime se determină în mod constant în urină &alfa - amilază (masa moleculară relativă 45 Ltd.) și uropepsin (greutate moleculară relativă de 38.000).

Împreună cu enzimele cu greutate moleculară mică în urina persoanelor sanatoase pot fi găsite în concentrații mici și alte enzime: lactat dehidrogenaza, aspartat și alanin aminotransferază, fosfatază alcalină, și KF, maltaza, aldolaza, lipază, protează și diverse peptidazei, sulfatază, catalază, ribonucleaza, peroxidaza [King, Boyce 1963].

Enzimele moleculară mare cu o masă moleculară relativă de peste 70000-100000, conform Richterich (1958) și Hess (1962), poate pătrunde în urină numai în încălcarea permeabilității filtrului glomerular. Conținutul normal al enzimei in urina nu exclude procesul patologic în rinichi cu ocluzie ureteral. Când epzimurii posibile enzime de ieșire nu numai de la rinichi în sine, ci și din alte organe parenchimatoase, membranele mucoase ale celulelor ale tractului urinar, prostata si elemente de urina formate cu hematurie sau leucocituriei.

Cele mai multe enzime nespecific în raport cu rinichi, prin urmare, de unde enzimele sănătoase și bolnave în urină, este dificil de stabilit. Cu toate acestea, gradul de enzimurii chiar lungimea enzimelor nespecifici, atunci când boala de rinichi este mai mare decât cea normală sau cea care se observă în boli ale altor organe. Pentru mai multe informații valoroase pot oferi un studiu cuprinzător al dinamicii unui număr de enzime, în special de organe specifice, cum ar fi transaminaza.

În abordarea problemei originii enzimei de rinichi în urină ajută pentru a studia izoenzimelor în identificarea fracțiunilor de organe tipice studiate. Izoenzime - ea enzimele prin acțiunea izogenice (catalizează aceeași reacție), dar eterogene în structura chimică și alte proprietăți. Fiecare material are o caracteristică pentru spectrul ei izoenzime. Valoroase izoenzimelor tehnici de separare sunt electroforeza în amidon și poliacrilamidă electroforeza în gel și cromatografia cu schimb ionic.

proteina Bence-Jones

In mielom multiplu si macroglobulinemia Waldenstrom în urină detectată proteina Bence Jones. Metoda de detectare a respectivei proteine în urină se bazează pe reacția termopretsipitatsii. Metodele folosite anterior prin care dizolvarea proteinei este evaluată la o temperatură de 100 ° C și reprecipitare cu răcire ulterioară, nesigure, deoarece nu toate corpurile de proteine Bence Jones posedă proprietăți corespunzătoare.

O detectare mai fiabilă a paraprotein prin precipitare la o temperatură de 40 -60 ° C Cu toate acestea, în aceste condiții de depunere nu se poate produce prea acid (pH < 3,0—3,5) или слишком щелочной (рН > 6,5) моче, при низкой ОПМ и низкой концентрации белка Бенс-Джонса. Наиболее благоприятные условия для его осаждения обеспечивает методика, предложенная Patnem: 4 мл профильтрованной мочи смешивают с 1 мл 2 М ацетатного буфера рН 4,9 и согревают 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белка Бенс-Джонса в течение первых 2 мин появляется выраженный осадок.

Când concentrația proteinei Bence Jones mai mică de 3 g / l, proba poate fi negativ, dar în practică este extrem de rar, deoarece concentrația sa în urină este în general mai semnificativ. La testul cu fierbere nu pot fi invocate în totalitate pe. Cu siguranță poate fi detectată în urină metoda imuno electroforetică folosind seruri specifice împotriva lanțurilor de imunoglobulină grele și ușoare.

NA Lopatkin

Distribuiți pe rețelele sociale:

înrudit