Polarizarea metodei anticorpului prin fluorescență. corelarea imunoglobulina

Pentru a aborda problema existenței de rotație independente subunități de imunoglobuline mare ajutor a fost metoda de polarizare de fluorescență. Abordarea de bază care a fost utilizată în aceste experimente pentru studiul imunoglobulinelor flexibilitate a constat în compararea corelației timp determinată experimental de molecule de imunoglobulină, găsit în experimentul care caracterizează timp molecula luminii plan polarizate, cu un timp de corelație calculat pe baza ipotezei că rigiditatea moleculei.

Deci, dacă presupunem că molecula IgG elipsoid rigid rotația axelor cu un raport de 1: 2 și o greutate moleculară de 150.000, timpul de corelare a moleculei trebuie să fie egală cu 73 nsec și observat experimental, a fost în general mai mic: 20-40 nsec. Aceasta indică abilitatea fragmentelor a mișcării relative independente și, prin urmare, porțiunile flexibile de legătură ale lanțurilor polipeptidice. Date similare au fost obținute prin etichetele de spin.

Stayer și Griffith (Stryer, Griffith, 1965) pentru determinarea corelației timp de haptene marcat spin legat la anticorp, a studiat comportamentul materiei care conține atât un fluorocrom grup, o etichetă de spin și o diferite soluții de vâscozitate.

Prin schimbarea viscozității soluție prin adăugarea de glicerol, a atins spectrul său EPR se potrivește cu spectrul haptenei marcat spin legat la situsul activ. În continuare, metoda de polarizare de fluorescență este determinată de timpul de corelare. Astfel gasit timp corelatie grupa N-O asociată haptenă marcată de spin sa dovedit a fi de 12 nsec. Autorii corect rețineți că această valoare poate fi prea mică în comparație cu timpul de corelare Fab-fragment, deoarece nu se poate exclude posibilitatea rotirii grupării relative imminoksilyyugo dinitrofenil inel, legat rigid cu centrul activ. Acest dezavantaj este comun pentru toate încercările de a determina timpul de corelare a IgG Fab-fragment folosind haptenă marcat spin.

">

Hsia și Piette (HSIA, PIETTE 1969) pentru determinarea corelației timp asociat cu centrul activ al haptenei marcate cu spin o dependență de calibrare de viscozitatea spectrele RPE soluției marker de spin. Timpul de corelare ce corespunde unui anumit interval, determinat de legea lui Stokes - Einstein, considerând că raza efectivă Stokes a mărcii este de 5 A. Cel mai scurt haptene cel mai strâns legat la situsul activ etichetat spin, a avut un timp de corelație de 39 nsec.

Dweck et al (Dwek e. a., 1975a), timp de corelație calculat a marcat spin-DNP localizate în centre active ale IgA (MOPC 315) și Fab- și Fv-fragmsntov. Sa dovedit a fi 44.4, 23 și 6.5 nsec, respectiv.

obținut anticorpii de iepure direct împotriva învârtire eticheta 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-amino (N-diclortriazină) deservite prin imunizare cu haptena. Rezultatul formării complexelor specifice de anticorpi și fragmente peptice papannovyh cu marker de spin are imobilizare puternică. Amestecarea unor cantități adecvate de soluții de IgG de iepure nespecifice și etichete condiții similare a rezultat numai în apariția spectrului EPR unei etichete liber. Etichetele de timp calculate de corelare Shimshiku și McConnel (Shimshick, McConnell, 1972). sa dovedit a fi de 32, 30 și 18, respectiv nsec pentru marker de spin complecși cu anticorpul, Fc- și Fab fragmente din punctul izoelectric (pH 6,3).
Valorile de timp obținute corelație IgG la Fab fragmente și confirmate în lucrarea citată.

Diferențele în timp corelație, obținut pentru Fab-fratmenta ca izolate și face parte din F (ab) 2 și anticorp intact indică restricții privind libertatea de rotație Fab fragmente, subunități impuse prin reacția F (ab) 2 și IgG. Creșterea temperaturii a dus la o scădere a redus la condițiile standard (3 * 105 P / ° C), timpul de corelare etichete complexe cu F (ab) 2 și IgG.

Aparent, atunci când este încălzit libertate relativ în mișcare le crește subunități. Posibilitatea de a obține anticorpi la un marker de spin, deservite de imunizare cu o haptenă este confirmată într-un alt studiu (Humphries, McConnell, 1976).