Bazele Terapie moleculara. terapia genică

Video: Baza moleculara a individualizare a terapiei cu mutații frecvente in NSCLC

conținut

Video: baza moleculara a individualizare a terapiei cu mutații frecvente in nsclc
Terapia genică

Stabilirea localizarea și secvența genei a cărei mutații provoacă boli specifice, precum și cele mai moderne metode de mutatie si testarea acestuia poate diagnostica boala in dezvoltarea neo- si chiar prenatale a organismului. Acest lucru face posibil pentru a atenua manifestarea unui defect genetic printr-un tratament de droguri, dieta, transfuzii de sânge, etc.

Cu toate acestea, această abordare nu duce la corectarea defectului și, în general, boala ereditară nu poate fi vindecată. Situația este complicată de faptul că mutația unei singure gene poate produce o varietate de efecte asupra organismului. Dacă mutația determină o schimbare în activitatea enzimei pentru care codurile, aceasta poate duce la acumularea unui substrat toxic sau, în mod alternativ, la un deficit de compus necesară pentru funcționarea normală a celulelor.

Un binecunoscut exemplu de o astfel de boală este fenilcetonurie. Aceasta este cauzata de o mutatie in gena pentru o enzima hepatica fenilalanindegidroksilazy catalizarea conversiei fenilalaninei la tirozina. Rezultatul este creșterea nivelului endogen de fenilalanină în sânge, ceea ce determină formarea improprie a tecii de mielină din jurul axonilor celulelor nervoase ale sistemului nervos central și, ca urmare, retard mintal sever.

Dacă mutația afectează gena proteinei structurale, atunci acest lucru poate duce la tulburări grave asupra nivelului de celule, țesuturi sau organe. Un exemplu de astfel de boli este fibroza chistica.

Deleția din gena care codifică o proteină numită transportorul fibroza chistica conduce la sinteza proteinei defecte (lipsa de fenilalanină 508) și tulburări de transport a ionilor de clor prin membranele celulare. Una dintre cele mai periculoase consecințe ale acestui fapt este că mucus care liniile si protejeaza plamanii, devine anormal de groase. Acest lucru complică accesul la celulele plămânului și contribuie la acumularea de microorganisme dăunătoare. Celulele mucoasei cailor respiratorii ale plămânilor, sunt ucise și înlocuite cu țesut cicatricial fibros (de aici numele bolii). Ca urmare, pacientul moare de insuficiență respiratorie.

boli ereditare sunt diferite simptome clinice complexe și tratamentul lor a traditsinnoe în principal simptomatic: pentru tratamentul fenilcetonuriei bezalaninovuyu prescris dieta, înlocuiți proteinele funcționale defecte prin administrare intravenoasă, pentru a compensa pierderea funcțiilor efectuate de transplant de măduvă osoasă sau de alte organe. Toate aceste măsuri sunt, de obicei ineficiente, scumpe, durabile, si putini pacienti supravietuiesc pana la batranete. Prin urmare, dezvoltarea de noi terapii este foarte urgentă.

terapia genică

Terapia genică este numit ingineria genetică a celulelor somatice umane, pentru corectarea defectelor genetice care cauzeaza boala. Corectarea bolilor specifice se realizează prin introducerea în celulele cu defecte ale genelor normale somatice exprimate. La o 80 de ani. Când sunt create metode dezvoltate pentru prepararea de gene individuale și vectori de expresie eucariote, devine experimente de transfer de gene de rutină la șoareci, corectarea perspectivei genetice devin reale.

În 1990 în SUA de către Dr. W. Anderson francez (W. Andrson Franceză) prima încercare de terapie genică pentru tratamentul imunodeficitare severe combinate (SCID), într-o fată de trei ani Ashanti de Silva (Ashanthi da Silva) au fost făcute. Aceasta boala este cauzata de o mutatie in adenozanadenilazu genei ce codifică (ADA). Deficiența acestei enzime facilitează acumularea de adenozină și deoxiadenozină de sânge, a cărui acțiune toxică duce la moartea a limfocitelor B și T în sângele periferic și, ca o consecință a imunodeficiență.

Copiii cu această boală ar trebui să fie protejate de orice infecții (conținute în camere sterile speciale), ca orice boala poate fi fatală. 4 ani de la începerea tratamentului copilului a observat expresia unui mod normal de functionare ADA SCID si ameliorarea simptomelor, ceea ce ia permis să părăsească camera sterilă și de a trăi o viață normală.

Astfel, a fost demonstrată în principiu posibilitatea terapiei genice cu succes a celulelor somatice. Deoarece 90-e. a testat o serie de terapie genica de boli genetice, printre care sunt cele mai grele, ca hemofilie, SIDA, diferite tipuri de tumori maligne, fibroza chistica si altele. In acest moment tratabile prin transgenesis aproximativ 10 boli umane.

O varietate de boli genetice predeterminate pluralitate de dezvoltare a abordărilor de terapie genica. Astfel rezolvat două probleme principale: un mijloc de a oferi metode gena- terapeutice pentru furnizarea de livrare direcționată către celulele destinate corecției. Până în prezent, toate abordările terapia genică a celulelor somatice pot fi împărțite în două categorii: (. Figura 3.15) Terapia ex vivo și in vivo.

Fig. 3.15. Schema de terapie genică ex vivo (a) și in vivo (a)

terapie genică ex vivo implică corectarea unui defect genetic al celulelor in afara corpului si revenind apoi celula care funcționează în mod normal în organism.

în terapia genică vivo implică livrarea de gene terapeutice direct in celulele unui țesut specific al pacientului. Luați în considerare aceste abordări mai în detaliu.

terapie genică ex vivo implică următoarele etape:
1) furnizarea de celule cu deficit de un pacient și cultivarea acestora;
2) transferarea genei dorite în celule izolate prin transfecția construcției genetice terapeutice;
3) selectarea și capacitatea celulelor corectate genetic;

4) transplant sau transfuzie a acestor celule în corpul pacientului.

Folosind celule proprii ale pacientului se asigură că, la întoarcerea lor nu a dezvolta un răspuns imun. transferul procedurii de construct de genă trebuie să fie eficace, dar o genă normală ar trebui să fie menținut stabil exprimat și în mod continuu.

Mijloace de transfer de gene create prin natura lor, sunt viruși. Pentru a obține vectori eficienți gena de livrare pentru grupul doi de virusuri sunt utilizate în principal - (. Vezi Figura 3.16) adenovirusuri și retrovirusuri. detoxifiat genetic variante de virusuri folosite in terapia genică.

Fig. 3.16. Virusurile utilizate pentru crearea de vectori terapeutici

Luați în considerare dispozitivul și utilizarea de modele bazate pe retro-virusuri. Să ne amintim că genomul retroviral conține două molecule identice monocatenare ARN, fiecare fiind format din șase secțiuni: două terminale lungi repeat (LTR) la 5` și 3` se termină secvența codificatoare * P + necesară pentru ambalarea ARN în particula virală și trei regiuni care codifică proteina structurală a capsidei interior (gag), revers transcriptaza (pol) și proteina de înveliș (env) (fig. 3.17, a).

Fig. 3.17. Harta genetică a unui retrovirus tipic (a) și o hartă vector retroviral (a)

Să ne amintim că ciclul de viață retrovirusuri cuprinde următoarele etape:
1. Infectarea celulelor țintă.
2. Sinteza copie ADN a genomului cu un revers transcriptaza nativ.

3. Transportul ADN-ului viral în nucleu.
4. Integrarea ADN-ului viral în cromozomul celulei gazdă.
5. ARNm Aranjamentul din ADN-ul viral sub controlul unui promotor puternic localizate pe porțiunea 5`-LTR.
6. proteine Broadcast Gag, Pol si Env.
7. Formarea capsidei virale și pachetul două lanțuri molecule de ARN și revers transcriptaza.
8. Eliberarea virionilor din celula.

La prepararea lungimii vectorului retroviral al virusului retro ADN inserat într-o plasmidă elimina cea mai mare parte a genei gag și complet pol gene și env, și în schimb inserat „terapeutic“ gena T și, opțional, o genă Rg marker selectivă cu propriul său promotor (Fig. 3.17, b ). gena T aranjament va fi controlat de același promotor puternic localizată pe porțiunea 5`-LTR. Pe baza acestei scheme oferă diferiți vectori retrovirali, iar dimensiunea maximă a insertului ADN de aproximativ opt mii. Bp

Structura astfel obținută poate fi utilizată ca atare pentru transformare, dar eficiența sa și integrarea ulterioară în genomul celulei gazdă este extrem de scăzută. Prin urmare, a fost dezvoltat ARN total vector retroviral tehnica de ambalare în particule virale intacte, care cu frecvență ridicată într-o celulă și să penetreze garantate integrat în genomul gazdă. Pentru aceasta asa-numita linie de celule „pakuyuschaya“ a fost stabilit. Cele două porțiuni diferite ale cromozomii celulelor cusute gene retrovirale gag și pol-env, lipsit de capacitatea de a ambala din cauza lipsei de consistență + (84 * +) (fig. 3.18).

Fig. 3.18. Schema de obținere a vectorului viral ambalat

Aceasta înseamnă că ambele aceste fragmente sunt transcrise, dar în același timp lipsit de un ARN capsidelor gol. Prin transfectarea vectorului viral ARN în astfel de celule este încorporată în ADN-ul cromozomial si este transcris pentru a produce lungime completă ARN retrovirusuri, și în aceste condiții ambalate în capsidele de numai vector ARN (doar ea conține o secvență +). Rezultate Particulele de virus intacte sunt utilizate pentru livrarea eficientă a vectorului retroviral în celula țintă.

Retrovirusurile infecta numai divizarea celulelor in mod activ pe scară largă. Pentru a transfera genele lor a fost tratat cu particule purificate ale vectorului retroviral ambalate sau co-cultivate cu o linie de celule producătoare de ei, iar apoi efectuați selecția pentru separarea celulelor țintă și a celulei de ambalare.

Celulele transduse au fost temeinic verificate pentru nivelul unei sinteze terapeutic produs genetic, absența replicării retrovirusului competente, nici o schimbare la capacitatea celulelor de a crește sau a funcției.

Deosebit de potrivit pentru terapia genică sunt celule de măduvă osoasă. Acest lucru se datorează prezenței celulelor stem embrionare totipotent, care pot prolifera și să se diferențieze în diferite tipuri de celule -B- și limfocite T, macrofage, eritrocite, trombocite și osteoclaste. Aceste celule sunt utilizate pentru a trata o serie de boli mostenite, printre care le-am menționat deja imunodeficiență severă combinată, boala Gaucher, siclemie, talasemie, osteoporoza si altele.

Pe langa celulele totipotent stem maduvei osoase, care sunt dificil de a izola și a cultiva celule stem pupovinnoy folosite din sângele (utilizarea preferată a terapiei genice pentru sugari) și celule hepatice - hepatocite - pentru tratamentul hipercolesterolemiei.

In terapia genică in vivo, este deosebit de important să se asigure livrarea genei terapeutice la celulele defecte. O astfel de livrare vizate poate furniza vectori care se bazează pe virusuri care pot infecta tipuri de celule specifice modificate. Luați în considerare abordarea dezvoltată pentru tratamentul deja menționate mai sus fibroza chistica. Deoarece plamanii sunt cavitatea deschise, genele terapeutice pentru furnizarea lor este relativ ușor. O variantă donată a unei gene sănătoase a fost introdusă într-un adenovirus inactivat (fig. 3.19). Specificitatea acestui tip de virus este ca acesta infecteaza mucoasa plămânilor, cauzând o răceală.

Fig. 3,19. Schema de obținere vector bazat pe un adenovirus

Concepute astfel încât virusul a fost testat prin pulverizare în nas și plămânii animalelor experimentale și apoi oameni-pacienți. În unele cazuri, acolo introducerea și expresia unei gene sănătoase și restabilirea transportului normale a ionilor de clor. Poate că această abordare (introducerea unei gene normale prin aerosol nazal), în viitorul apropiat, vor fi utilizate pe scara larga pentru a trata simptomele de fibroza chistica in plamani.

Pe lângă retro- și adenovirusuri în experimente de terapie genica privind utilizarea și a altor tipuri de virusuri, cum ar fi virusul Herpes simplex. O caracteristică a acestui dublu catenar (152 mii. Bp) virus ADN este capacitatea sa de a lovi în mod specific neuroni. Exista multe boli genetice care afectează sistemul nervos central și periferic - tumori, tulburări metabolice, boli neurodegenerative (boala Alzheimer, boala Parkinson).

Herpes simplex virus tip I (HSV), vectorul este foarte potrivit pentru tratamentul unor astfel de boli. Capsidei virusului fuzionează cu membrana unui neuron, iar ADN-ul este transportat în nucleu. Acesta a sugerat mai multe modalități de transfer a unei gene terapeutice prin HSV-vectori și testate cu succes la animale experimentale.

Vectorii virali au mai multe dezavantaje: cost ridicat, capacitatea limitată a reacțiilor inflamatorii donate și posibile. Deci, în 1999, ca urmare a care a dezvoltat un răspuns imun neobișnuit de puternic pentru vectorul adenovirus a fost ucis voluntar în vârstă de 18 de ani, care a luat parte la studiile de droguri. În 2002, doi copii în Franța, în timpul tratamentului imunodeficienței (introducerea de gene terapeutice in celule stem folosind retrovirusurilor) a dezvoltat o condiție similară cu leucemie.

Prin urmare, a dezvoltat sistemul de livrare a genei nonviral. Cel mai simplu și cel mai ineficient mod - este o injecție a ADN-ului plasmidic în țesut. A doua abordare - este microprojectile țesături cu bombardament de aur (1-3 microni) ADN conjugat. Astfel, genele terapeutice sunt exprimate în țesuturile țintă și produsele lor - proteine terapeutice - intra in fluxul sanguin. Principalul dezavantaj al acestei abordări este inactivarea prematură sau distrugerea acestor proteine cu componente sanguine.

Livrarea de ADN poate fi realizată prin ambalare-l într-o membrană lipidică artificială. Particulele sferice astfel obținute, lipozomii pot pătrunde cu ușurință prin membrana celulară. Lipozomii create cu proprietăți diferite, dar până acum eficiența acestei livrare este scăzut, deoarece cele mai multe ADN-ul a fost supus lizozomale de degradare. De asemenea, sintetizat conjugați ADN pentru livrarea constructului genetic la diferite molecule capabile să asigure siguranța acestuia, livrare vizate și penetrarea în celulă.

In ultimii ani, experimente intensive pentru a crea cromozom artificial 47, ceea ce ar permite să includă o cantitate mare de material genetic cu un set complet de elemente de reglementare pentru una sau mai multe gene terapeutice. Acest lucru ar face posibilă utilizarea unei versiuni genomice a unei gene terapeutice și, astfel, să asigure stabilitatea și exprimarea eficientă pe termen lung. Experimentele au arătat că crearea de cromozomi umani artificiali care conțin gene terapeutice este realist, cu toate acestea, nu este clar modul în care o astfel de moleculă enormă introdusă în nucleul celulei țintă.

Principalele probleme cu care se confruntă terapia genică, în plus față de riscul reacțiilor imune severe sunt stocare dificile pe termen lung și funcționarea ADN-ului terapeutic în corpul pacientului, multe boli multigenici, ceea ce le face dificil de tinta pentru terapia genică și riscul utilizării virusurilor ca vectori.

NA Warriors, TG Volova

Distribuiți pe rețelele sociale:

înrudit