Genele Terapia cu efect responsabil pentru sinteza proteinelor actin și distrofinei cardiace pe dezvoltarea insuficienței cardiace cronice la pacienții cu miokardai miocardic cardiomiopatie dilatativă

DPentru a înțelege mecanismele de dezvoltare și progresia insuficienței hronicheskoyserdechnoy Cercetare (ICC) poslednihlet se concentreze pe evaluarea contribuției factorilor genetici vrazvitie insuficienta circulatorie. Perspektivnympodhodom Acest lucru se datorează faptului că este detectat riscul genetic si complicatiile proiskhoditprognozirovanie ale bolii până la klinicheskihproyavleny lor [1, 2]. Astfel, în prezent asupra patogenezei moleculare a cardiomiopatiilor urovnerassmatrivaetsya ca proiskhoditnarushenie în procesul de exprimare a genei, în special mehanizmovpretranslyatsii, traducere și posttranslyatsii care duce la izmeneniyufenotipa [2]. lucru pentru a identifica genetice CHF faktorovrazvitiya la pacienții cu cardiomiopatie dilatativă (DCM), cunoscut, în special la acești pacienți au arătat mutații la diferite uchastkahgenov responsabile pentru sinteza proteinei distrofină și actină [3, 4,5, 6].
Nu există rapoarte publicate de distrofina mutatsiigena, și actina la pacienții cu infarct miocardic, hotyamozhno presupune că o mutație similară este posibilă sub vliyaniemstressa și a mecanismelor de activare neurohormonali.
În acest sens, scopul lucrării a fost issledovaniegenov actina și distrofină la pacienții cu cardiomiopatie dilatativă idiopatică, persoanele UY cu infarct miocardic.

Materiale și metode

La issledovanievklyucheno 130 de pacienți, inclusiv 104 bărbați și 26 femei, vozrasteot 21 la 88 de ani. Pacienții au fost împărțiți în trei grupe: prima grup- macrofocal și pacienții cu infarct miocardic acut transmural, complicat CHF II - IV FC de NYHA, grupa 2-a - cu miokardabez miocardică semne clinice de insuficiență cardiacă, pacienții grup- 3 cu cardiomiopatie dilatativă idiopatică CHF II - IV FC. grup Kontrolyasostavilo de 30 de persoane, inclusiv 21 de bărbați și 9 femei, vozrasteot 25 la 76 ani (vârsta medie 55,5 ani), fără sosudistoypatologii cardiovasculare și fără boli cronice severe.
Caracteristicile clinice și demografice bolnyhpredstavlena de masă.
Studiul genelor de actină și distrofina proizvodilosv Institutul de General Genetics, de laborator și de mediu radiatsionnoygenetiki Institutul de Biologie gene RAS.
tselnayakrov a fost utilizat pentru extracția ADN-ului, luată într-un tub de testare cu EDTA la o concentrație finală de citrat 50mMili cu o concentrație finală de 0,5%. Izolarea ADN-ului provodilis folosind "DiatomTMDNA Prep 200" kit de reactiv (fabricat de "Biokom"). Baza de izolare a ADN-ului, folosind această utilizare naboralezhit lizeze reactiv la DNA guanidintiotsionatomi sorbentului „nucleos“. În prezența unor concentrații ridicate guanidintiotsionata (4M) ADN adsorbiți pe suprafața activă a particulelor „nucleos“, iar componentele sanguine rămase rămân în mediu, care este apoi udalyayutsyatsentrifugirovaniem. ADN spălate spirtosolevym tampon zatemsmyvaetsya sorbent extragenic cu un amestec de schimbător de ioni și pentru stabilirea reacției în lanț a polimerazei napryamuyuispolzuetsya (PCR) Izolarea ADN-ului din sânge integral realizată în conformitate cu un set instruktsieyispolzovannogo „DiatomTMDNA Prep 200“ „Biokom“ firmă.
Pentru detectarea mutațiilor în metoda genei kardioaktinaispolzovali de PCR-RFLP, produs PCR prin enzima de restricție rezhetsyasootvetstvuyuschey, recunoaște un punct de interes nukleotidnuyuzamenu. Cu enzima de restricție Bcl I situs de restricție (-TGATCA-) vyyavlyaetmissens mutație G (norma) la A (mutație) dizolvat în kardioaktina gena 5-exon asociate cu cardiomiopatie dilatativă idiopatică. Sintezpraymerov pentru a 5-cercetare exon a fost kardioaktina sintetizator exploatație PE Applied Biosystems (USA). Primerii Compozitie: F 5 / -gactcgttcccaggtatg R5 / -gatctcccactcacaaaag.
Amplificarea PCR a fost efectuată după cum urmează rezhimeamplifikatsii: 950S - 40, 580S - 30, 740S - 40 până la 30 de cicluri.
Dimensiunea fragmentului amplificat 222 parynukleotidov. Concentrațiile finale ale amestecului de reacție PCR: 67 mMTris Hcl c pH = 8,8, 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 unități. Taq.polimerazy, 200mM dNTP fiecare, 0,5 mM din fiecare ADN 10-20ng primer investigat, 1,5 mM MgCI₂,volum final de PCR amestec de 30 ml.
Pentru a analiza amplificarea rezultate 10 produs mklPTsR a fost aplicat la o electroforeză în gel de agaroză 2%. vgele ADN dezvoltat cu bromură de etidiu în lumină UV a lungimii de undă de 32nm. După evaluările vizuale amestec PCR PCR concentrație produs opredelyaliobem necesare pentru setarea reacției de restricție (5 până la 10 l de PCR amestec).

Investigarea genei distrofinei

Pentru obnaruzheniyamutatsii în gena distrofină folosind metoda PCR cu sikvensspetsificheskimipraymerami (PCR-SSP), prin care ispolzuetsyapara pentru primeri PCR, dintre care unul conține una sau două tochechnyezameny. Una dintre substituții este un înlocuitor tochechnuyunukleotidnuyu interesant. Principiul metodei este că primerii temperatură prioptimalnoy recoapte în absența mutației apare bandă specifică a produsului PCR, iar în cazul mutatsiipri aceeași temperatură și recoacere primeri amplifikatsiine reacția are loc. Selectate două perechi sikvensspetsificheskih praymerovprednaznacheny pentru a detecta mutația missense de la A la G în distrofina ekzonegena a 9-a secvenței normale si o mutatie sootvetstvennosvyazannaya cu cardiomiopatie dilatativă idiopatică X-legate.
Sinteza de primeri pentru cercetare al 5-lea ekzonakardioaktina a fost realizată pe sintetizatorul PE Applied Biosystems (USA).
Componența primer: Dn 5-gta AAT gtt GAC aga cctgtg 5-GAA cct ctc TCG CAG atc acg Dm 5-gta AAT gtt GAC aga cctgtg 5-GGA tcc TCT ctc GCA CGC un revolver
Amplificarea PCR a fost realizată după cum urmează: rezhimeamplifikatsii 950S - 40 s, 560C - 30, 740S - 40 pentru 35 de cicluri.
Dimensiunea fragmentului amplificat 160 parnukleotidov. Concentrațiile finale ale amestecului de reacție PCR: 67 mMTris Hcl c pH = 8,8- 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 unități. Taq polimeraza, 200mM dNTP fiecare, 0,5 mM din fiecare ADN 10-20ng primer investigat, 1,5 mM MgCI₂,volum final de PCR amestec de 30 ml.
Tabel. Caracteristicile clinice și demografice ale pacienților.

Pentru a analiza rezultatovamplifikatsii 10 pl de produs PCR a fost aplicat pe gel de agaroză 2,5% au prezentat elektroforez.DNK gel cu bromură de etidiu în lumină UV nm volny320 lung.
Pentru a detecta o mutație punctuală în issleduemyhprobah înregistrate amplifitsirovannogofragmenta prezența sau absența unei perechi de primeri respective:
1. Prezența unui fragment PCR de 160 de perechi de primeri de amplificare nukleotidovpri pereche pentru posledovatelnostiukazyvaet normală pe norma.
2. Absența fragmentului PCR cu 160 parnukleotidov amplificare pereche de primeri pentru normalnoyposledovatelnosti indică prezența mutației intenționat.
3. Prezența unui fragment PCR de 160 perechi de nukleotidovpri perechi de primeri de amplificare pentru secventa mutatsieypodtverzhdaet cu mutatie.

Rezultate și discuții

După cum sa menționat, în literatura de specialitate nu există rapoarte despre mutația genei iaktina distrofină la pacienții cu boală cardiacă ischemică, în special infarctul sinfarktom, deși sub influența neurohormones și a altor substanțe biologicheskiaktivnyh, care sunt activate ca răspuns la povrezhdenieserdechnoy musculare (în acest caz, infarct miocardic), vozmozhnopredpolozhit o mutație similară. Cu toate acestea, în ciuda condițiilor pravilnyeteoreticheskie și așteptările noastre, au fost gasite mutatie a genelor de pacienți studiați. Mai mult decât atât, nu opredelyalasmutatsiya și la pacienții cu cardiomiopatie dilatativă, deși în ultimii ani în rezultateryada cercetare au obținut rezultate semnificative suficiente, datorită mutațiilor genei kotoryekasayutsya distrofină și actinei cu inima nedostatochnostyu.V special, R. Ortiz-Lopez și colab. [2] a investigat genomnuyuDNK 3 familii care nu au legatura cu cardiomiopatie dilatativă X-legate.Grupul de control a constat din 50 de persoane de sex feminin și 50 rude neyavlyayuschihsya de sex masculin. Pentru amplificarea ADN-ului a fost folosit PTSR.V rezultatul studiului într-una dintre familiile cu X-linked DKMPbyla gena identificat care codifică mutația distrofina lokalizuyuschegosyav cromozomului 21, în special, a constatat înlocuirea adeninei exonul guaninv 9 la poziția 1043, ceea ce a condus la sinteza nepolyarnoyaminokisloty hidrofobe alanină în loc de hidrofil polar treonină prezentă în distrofina în poziția 279, cu privire la kN-terminal al distrofina. Înlocuirea treoninei prin alanină izmeneniyupolyarnosti conduce la capătul N-terminal al proteinei și, prin urmare, o distrofina structură terțiară schimbare vtorichnoyi. Astfel, această mutatsiyayavlyaetsya cauza pierderea de stabilizare a membranei tulburări funcției etogobelka și activitatea funcțională a cardiomiocitelor, chtoi duce la boli degenerative legate de X miokarda- cardiomiopatie dilatativă X-linked.
F. Muntoni și colab. [4] și Milasini J. și colab. mutații [5] au descris în alte site-uri porțiuni ale genei distrofina.Eti au fost investigate R. Ortiz-Lopes et al. [3] tehzhe 3 familii cu cardiomiopatie dilatativă X-linked, mutatii in aceste site-uri au fost vyyavlenone. Prin urmare, ne putem gândi la diverse mecanisme de dezvoltare veduschihk distrofinopaties.
Astfel, orice distrofinaprivodit mutație la o deficienta de proteine ​​miocardic care yavlyaetsyaprichinoy absența glicoproteinelor distrofinassotsiirovannyh miocardice [7, 8] responsabile pentru legarea matricei extracelulare multiproteinnogo complex sbelkami. Rezultatul acestei yavlyaetsyadezorganizatsiya cardiomiocite, ceea ce duce la o schimbare în infarct mehanicheskoymodeli, tulburări ale funcției sale de pompare si insuficienta cardiaca.
În ceea ce privește mutația actinei cardiace, tovarășul în 1998 a publicat o lucrare T. Olson și colab. [6] demonstrat prin studii de doi autosomal semeys cardiomiopatie fără legătură dominant idiopatică (o origine semyanemetskogo, al doilea - suedez-norvegian). Pentru vsehchlenov efectuat ecocardiografie, biopsiyamiokarda, DCM identifica trăsăturile caracteristice (interstitsialnyyfibroz focală și hipertrofia cardiomiocitelor). Pentru detectarea mutațiilor genei actin PCR a fost utilizată. două singure gene mutatsiietogo identificate: una - în gena kardioaktina 5a exonul (înlocuind adenină guaninana, ceea ce conduce la sinteza de codificare a histidinei în 312 mpolozhenii în loc de arginină), iar cealaltă - la exonul a 6 (înlocuirea adeninana guanina, având ca rezultat sinteza a apărut 361 poziția glutamina glitsinavmesto). Dar ar putea fi luate în considerare aceste modificări vramkah kardioaktina genei polimorfism. Pentru a exclude astfel de predpolozheniyaprotestirovany 435 de persoane care nu au legătură descrise mutație a fost să nu le vyyavlenou. Prin urmare, aceste realizări assotsiiruyutsyaimenno gena actinei cu cardiomiopatie dilatativă idiopatică.
Faptul că munca noastră nu a putut fi detectat actina mutatsiyagenov și distrofina nu este o declarație directă că mutația nu a făcut-o. Poate că mutația apare vbolee fazele ulterioare ale bolii? Trebuie remarcat faptul că, în nashemissledovanii nu a efectuat analize genetice în familiile cu idiopaticheskoyDKMP și persoane care nu au legătură au fost luate. Probabil pentru glubokihvyvodov au nevoie, de asemenea, o populație mare în termeni issledovanie.I nu poate fi gene de studiu mai puțin semnificative drugihstrukturnyh componente ale mușchiului cardiac, în special mutatie elastina kollagenai care poate avea, de asemenea, o valoare în razvitiiHSN.

Referințe:
1. Tereschenko SN Clinicopathogenetic aspecte genetice ale insuficienței cardiace cronice ivozmozhnosti de corecție de droguri. / Diss. ... Dr. miere de albine. nauk.- M. 1998- 287.
2. Bristow M. R. De ce miocardul nu? Insights de stiinta de baza. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ortiz-Lopez R., Li H., Su J., Goytia V., Towbin J.A. Dovezi pentru o missensemutation distrofina ca o cauza de cardiomiopatie dilatativă X-legate. // Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F., Cau M., Ganau A., congiu R., Arvedi G., Mateddu A., Marrosu ke, Cianchetti C., Realdi G., Cao A., Melis M.A. Scurt raport: eliminarea distrofinei musculare-promoterregion asociate cu cardiomiopatie dilatativă X-legate. // N.Engl. J. Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasin J., Muntoni F., Severini GM, BartoloniL., Vatta M., Kraoinovic M., Mateddu A., Angelini C., CameriniF., Falaschi A., Mestroni L., Giacca M. și HMD Grupul de studiu . Apoint mutație în 5` situs de splicing al genei distrofină firstintron responsabil pentru X-linked cardiomyopathy.// dilatate Hum.Mol. Genet. 1996- 5: 73-9.
6. Olson T.M., Michels V.V., Thibodeau S.N., Tai Y.S., Keating M.T. Actina mutatii in cardiomiopatie dilatativă, o forma ereditara de insuficienta cardiaca. // Stiinta. 1998- 280: 750-2.
7. Bies R.D., Maeda M., Roberds S.L., HolderE., Bohlmeyer T., Young J.B., Campbell K.P. O duplicationmutation 5` distrofină cauzează deficit de membrană de alfa-dystroglycan în afamily cu cardiomiopatie X-legate. // J. Mol. Cell. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Franz W.M., Cremer M., R. Herrmann, GrunigE., Fogel W., Scheffold T., Goebel H.H., Kircheisen R., KublerW., Voit T. și colab. X-linked cardiomiopatie dilatativă. Romanul mutationof gena distrofină. // Ann NY Acad. Sci. 1995- 752: 470-91.