Radioimunotest Blood (RIA) cerere

In 1956 au fost descoperite la pacienții tratați cu insulină, anticorpii nepretsipitiruyuschie capabili de legare ¹³¹I-insulină. Apoi, acest grup de cercetare a aratat ca insulina nemarcată concurează cu anticorpul marcat pentru legarea și dislocă-l din complexele imune. Ulterior, Berson și Yalow a dezvoltat prima metodă pentru măsurarea RIA a concentrației insulinei în ser, pentru care au fost primit Premiul Nobel. In aceasta metoda, insulina legat de anticorpi a fost separat de insulina nelegat prin electroforeză hârtie. Aproximativ în același timp, în anii 1960., Grodsky și Forsham descriu o metodă similară, folosind RIA ¹³¹I-insulină, dar separarea hormonului legat și nelegat, au fost utilizate în loc de sărare electroforeză.

O contribuție enormă la dezvoltarea RIA Hales și Randle făcute în 1963 pentru a separa hormonul legat și nelegat au folosit anti-y-globulină, așa-numiții anticorpi secundari. Această abordare se bazează pe activitatea Skom și Talmadge, care în 1958 a arătat că anticorpii secundari determina precipitarea complexelor „anticorp-antigen primar.“ Hales și metoda Randle, numită „metoda de anticorp dublu“, sa dovedit a fi mult mai sensibilă și specifică decât versiunile anterioare ale RIA.

In 1963, Herbert et al. Am dezvoltat o tehnica pentru separarea complexelor „antigen-anticorp“ din antigenul nelegat prin cărbune activat acoperit cu dextran. Metoda se bazează pe proprietatea amestecului dextran cărbune substanțial absorb instantaneu antigen liber fără a se lega cu complexele antigen-anticorp. Această tehnică permite să se separe complexele imune mult byst7 yardarm decât tehnicile pretsipitatsionnye, astfel încât să puteți utiliza ¹³¹I-antigeni cu activitate specifică redusă etichetate de Hunter și Greenwood.

Video: Invata desene animate Winx?

În același timp, Utiger et al. gamă extinsă de aplicații RIA, dezvoltarea unei metode de cuantificare a hormonului de creștere uman. Mai târziu, Greenwood și colab. Metoda de STH iodarea implementat, permițând obținerea hormonului etichetat cu o activitate specifică de 200- 500 mCi / mg (6000-9000 Ci / mmol).

Aceasta tehnica este folosita si astazi. Esența ei constă în faptul că izotopul iod (1311 sau 1251) în compoziția de iodură de sodiu este oxidat de cloramină T și sub această formă înlocuiește unul sau mai mulți atomi de hidrogen din ciclul fenil al tirozinei și histidină inel de imidazol. După 1 min, amestecul de reacție se adaugă un agent de reducere, pentru a evita deteriorarea nejustificată a hormonului. Rețineți că principiul iodarea oxidative a proteinelor a fost descrisă în Hughes 1957 In continuare Meyer Knobil și dezvoltat pentru măsurarea RIA a hormonului de creștere simian și uman, în care cărbunele activ utilizat pentru separarea hormonului nelegat.

Originea RIA pentru a masura nivelul de hormoni gonadotropi (în acest caz - LH), dezvoltat în 1966, la bazate pe utilizarea anticorpilor la CG uman, deoarece acesta a fost demonstrat anterior că acești anticorpi se leagă la om și LH. Unul dintre experimente în acest domeniu a făcut o adevărată revoluție în immunochemistry: Catt et al. Am constatat că anticorpii sunt în măsură să adere la discurile de polistiren diazotat. Astfel, eliminând nevoia de separare a complexelor complexului antigen-anticorp prin precipitare sau adsorbție. Mai târziu, Catt și colab. învățat anticorp imobilizat direct cu polistirenul nesaturată într-un mediu alcalin. Rezultatele acestor studii a servit ca bază pentru crearea ELISA (a se vedea. De mai jos). Faiman și Ryan pentru prima dată, a reușit să obțină un antiser la gonadotropină pituitară - LH uman. Ulterior RIA pentru determinarea LH de șobolan au fost dezvoltate.

Dezvoltarea RIA pentru a măsura nivelurile de FSH, la fel ca în cazul LH, începe cu un ochi pe viitor de cercetare clinica. În 1967 și 1968. mai multe grupuri de cercetare au raportat cu privire la noile metode de RIA pentru diferite forme de FSH uman. Toate acestea s-au bazat pe metoda de anticorpi duble.

În 1967, Aria și Lee pentru prima dată, a anunțat o metodă de determinare a prolactinei, pe baza metodei de anticorpi duble. Prima măsurare a nivelului de prolactină prin RIA au fost efectuate în absența materialului uman în plasmă de ovine și bovine.

Fundamentele teoretice ale RIA

Primele metode RIA (de exemplu, metode de Berson și Yalow sau Grodsky și Forsham) s-au bazat pe fenomenul de inhibiție competitivă. Acest fenomen constă în faptul că legarea hormonului marcat cu izotop (antigen trasor) cu anticorpi specifici inhibat în prezența hormonului nemarcată (antigen nemarcată). Fenomenul de inhibare competitivă poate fi descrisă prin două ecuații: „marcat antigen + anticorp complex este marcat«și»antigen nemarcată + anticorp <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

De obicei RIA efectuate la 4 sau 37 ° C în soluție salină tamponată cu fosfat la pH 7 sau 8. Reacția poate dura de la 2 până la 24 ore (în funcție de afinitatea anticorpului și nivelul dorit de sensibilitate). Rețineți că automatizarea analizei și metode îmbunătățite de anticorpi care produc redus semnificativ timpul de reacție. Când amestecul de reacție, se stabilește un echilibru, complexele antigen-anticorp sunt separate prin precipitare cu anticorpi secundari, antigene și absorbția de anticorpi liberi de pe cărbune activ sau precipitare într-un mediu de înaltă densitate, cum ar fi polietilen glicol. Dacă o fază solidă RIA, mediul de incubare este pur și simplu îndepărtată și complexele antigen-anticorp rămân pe polistiren sau altă fază solidă. În ultima etapă complexele de radioactivitate. În cazul în care hormonul a fost semnalat ¹²⁵I sau ¹³¹I, folosind contra radiațiilor dacă eticheta a servit 3H, particule folosind un contor de scintilație. concentrația de hormon din probele sunt calculate dintr-o curbă de calibrare preparată din măsurători în probe standard cu concentrații cunoscute ale hormonului.

Prepararea anticorpilor

anticorp policlonal a fost preparat prin imunizare antigen RIA (hormon) animale din specii diferite, inclusiv iepuri, găini, porci de guineea, rațe, oi și capre. Pentru un anticorp primar (anti-hormon de) utilizat în mod normal la iepuri și cobai pentru anticorp secundar (anti-primar) - ovine și caprine.

Video: Alergii la câine rasa Pudel

Există mai multe metode de imunizare, cele mai frecvente - injectarea de antigen în laba piciorului, sau în nodul limfatic regional sau splina. Deoarece în gazdă există antigeni pentru un timp scurt, pentru inducerea fiabilă a unui răspuns imun folosind adjuvant Freund. antigeni non-imunogen greutate moleculară joasă (de exemplu, hormoni steroizi) și antigene cu imunogenitate scăzută, înainte de imunizare atașat la molecule mari sau particule (albumină metilată, feritina, dextran, Sephadex și m. P.). Imunizarea este în general realizată în mai multe etape, cu intervale de 2 săptămâni. De obicei, după mai multe injecții cu titrul de anticorpi în ser este în creștere rapidă. Sânge pentru ser imun luate din cavitățile inimii sau ale venelor și arterelor urechii. Ultima metodă este cel mai des utilizat la iepuri. Serul rezultat a fost incubat timp de 30 minute la 57 ° C pentru a distruge complement. Apoi, serul se adaugă conservant pentru a preveni creșterea bacteriilor și fungilor (azidă de sodiu sau thimerosal).

anticorpi monoclonali

În 1975, Kohler și Milstein a dezvoltat o nouă fundamental - hibridoma - tehnologie pentru producerea de anticorpi. Mai târziu, această evoluție a fost distins cu Premiul Nobel. Vom descrie principalele elemente ale acestei tehnologii.

Șoarecii sau șobolanii sunt imunizați cu un antigen, cum ar fi un hormon. Când titrul de anticorpi în serul devine suficient de mare la animale imune din celulele plasmatice izolat sat ZENK printre care există celule - producători de anticorpi la antigenul inițial. Celulele plasmatice in celulele de mielom in vitro hibridizați animale din aceeași specie derivate. Suspensia de celule a fost transferată într-un mediu de selecție în care numai celulele hibride supraviețuiesc, iar celulele plasmatice și mielom Nye pier. Hybrid reprezintă un cap de serie în godeurile unui alimentator de mediu clorhidric unde acestea sunt divizate și hibridoamele formă (linii celulare imortalizate). Dintre multitudinea de selecta acele hibridoame care produc anticorpi de antigenul dorit și se multiplică mediul lor nutritiv sau în cavitatea peritoneală a șoarecilor singenici. De mediu pitatelno- sau anticorp izolat fluid de ascită. Acești anticorpi sunt numite monoclonali, deoarece acestea sunt produse de un hibridom sunt descendenți ai unei singure celule plasmatice. Anticorpii monoclonali produși de un hibridom, recunosc doar un epitop al unui antigen. Aceasta este diferența fundamentală dintre anticorpii monoclonali dintr-un antiser policlonal, care conține în mod normal, mai mulți anticorpi diferiți față de diferiți determinanți ai antigenului.

Unul dintre cele mai importante avantaje ale anticorpului monoclonal minciunilor policlonali în faptul că același tip de anticorpi monoclonali cu specificitate definită și afinitate pot fi produse în orice cantitate și practic infinit (ca hibridom nemuritoare). In contrast, o compoziție de anticorp de antiseruri policlonale este foarte variabilă, care trebuie verificat fiecare lot nou de antiser și selectarea condițiilor de aplicare a acesteia. Astfel, utilizarea anticorpilor monoclonali mult mai ușor de a standardiza RIA și alte teste imunochimice.

hormoni Obținerea, marcate radioactiv

După cum sa menționat deja, pentru iodarea de hormoni proteine ​​utilizate cel mai frecvent metoda propusă de Greenwood și Hunter. Folosit inițial ca o etichetă ¹³¹Eu, dar din cauza timpului de înjumătățire scurt al acestui izotop (8 zile) termenul de valabilitate al hormonului marcat a fost mic. In 1967, Wilde și colab. utilizat pentru iodarea ¹²⁵I (T_1/2 = 60 zile). De atunci, izotopul folosit pentru a eticheta orice proteină, iar unii hormoni neproteice. Astfel obținut hormonii marcați cu activitate specifică de 100-250 mCi / mg. Acest lucru este suficient pentru detectarea fiabilă a particulelor în contorul de radiații.

Pentru etichetarea utilizării hormonului neproteic și alți izotopi radioactivi, cum ar fi particulele de radiatoare ³H sau ¹⁴C. etichetate ³H sau ¹⁴Steroizii C sunt utilizate nu numai în analiza imunochimice de hormoni, dar, de asemenea, în studiile endocrinologice fundamentale, de exemplu, pentru a studia localizarea receptorilor steroidieni în diferite celule și țesuturi ale animalelor experimentale.