Metode pentru diagnosticul de laborator al infecției cu Chlamydia în sinuzita maxilară

Video: Otorinolaringolog Ponidelko SN (Clinica SM)

I. Metoda Tsitoskopichesky de detectare Chlamydia

Acesta a sugerat două metode care pot fi împărțite în invazive și non-invazive. REZUMAT Primul este acela că materialul pentru studiu este conținutul sinusurilor maxilare, rezultând în Kulikovskii ac de puncție care, după centrifugare a fost utilizată pentru prepararea frotiurilor.

A doua metodă este următoarea: după nazal anemizatsii soluție 0,1% și aplicarea epinefrinei anestezie regiunea mijlocie a pasaj nazal dikaina Soluția 3% - 0,3 ml, folosind perii de unică folosință speciale transportate materialul gard în timpul mișcărilor de rotație între 10-15 suprafata mediala a cornetul mijlociu și peretele nazal lateral în zona paranaza sinusurilor anastomoze. Materialul astfel obținut este uniform distribuit pe o lamelă de sticlă, uscat cu aer și fixate în acetonă timp de 10 min, la 4-6 ° C Tampoane Ready pot fi stocate pana la studiu timp de 2 săptămâni. la o temperatură de 2-6 ° C

Pictura pe Romanovsky-Giemsa. Ex colorant tempore diluat cu apă distilată 1:10. Lamelele au fost plasate într-un vas Petri pe stick-uri de lemn în jos de droguri. Spațiul dintre accident vascular cerebral și partea de jos a paharului este umplut cu colorant. Vopsirea se efectuează timp de 45 minute. Apoi, sticla se spală bine cu jet de apă, se usucă cu hârtie de filtru și se diferențiază în alcool acidifiat (100 ml 96% etanol, se adaugă 10 picături de acid acetic glacial). După vopsire preparatele sunt vizualizate la microscop optic utilizând lentila de imersie (X90). In acest caz, citoplasmă celulei pătată albastre, nuclei - în albastru-violet incluziuni citoplasmatic Chlamydia sunt determinate ca un întuneric microcolonii albastru sau roz pe un fundal albastru citoplasmei. In etapa corpusculi elementari incluziunilor Chlamydia sunt pătate pas roz a celulelor inițiale în albastru (Ponidelko SN, 2001). Pentru a crește conținutul de informații al studiilor morfologice metodă efectuate în numărarea numărului de neutrofile, limfocite și macrofage în frotiuri pregătite înainte de tratament și dinamicii sub influența drogurilor administrate.

II. Metoda de imunofluorescență directă

Frotiuri preparate din materiale soskobnyh, precum și frotiu de sânge colorat cu un amestec luate în diluțiile de lucru imunoglobulina polivalenta chlamydia fluorescente și albumină bovină, etichetate cu rodamin pentru contrastante de fundal. Utilizați diluției de lucru seruri 1 / 20-1 / 40. Lamelele cu materialul de testat și colorant plasat a fost plasat într-o cameră umedă într-un termostat timp de 30 min, după care sticla este îndepărtată și spălată în mod extensiv în soluție salină tamponată cu fosfat (pH 7,2) pe un agitator magnetic timp de 1 oră, schimbând tamponul după 30 de minute. Pe frotiul uscat aplicat o picătură de glicerol tamponat (9 ml glicerol și 1 ml de soluție salină tamponată cu fosfat), iar apoi acestea sunt acoperite cu un capac de sticlă (Ponidelko SN, 2001). Pregătirile sunt navigarea sub microscop cu fluorescență „LUMAM-OUT“. Analiza profitabilității se realizează vizual. Rezultatele sunt considerate pozitive, în cazul în preparatul detectat elemente tipice morfologic chlamydia specific fluorescent smarald-verde sau galben-verde:

Celulele Chlamydia reticular (PT) si cluster de chlamydia in citoplasmă sub forma microcolonii, care au forma unor formațiuni compacte, prolix colorate de diferite dimensiuni - de la 0,25 până la 1,5 microni;
Chlamydia organisme elementare (EbS) - formarea care sunt în principal în afara celulelor, formă sferică sau ovoidală având distinct rim circumferențială colorat sub forma unui inel închis sau semiring dimensiune 0,25-0,5 mm;
situat intercelular includerea - mari pete verzi luminoase formate sunt aproape unul de celălalt ET.

III. metode serologice

Volumul de sânge în 2,5-3,0 ml la pacienții jeun luate din vena cubital într-un tub de centrifugă uscat. Tubul cu sânge, în vederea unei mai bune cheag retracție corpusculi incubate la 37 ° C timp de 40-45 min. După incubare tubul este centrifugat 20 min la 3000 rot. / Min cheag „încercui“, iar tubul a fost plasat timp de 1 oră în frigider și apoi, folosind o pipetă Pasteur, serul a fost separat de precipitat. Serurile au fost transportate la laborator în următoarele 1.5-2 ore sau depozitate la 4-6 ° C timp de 1-3 zile. probele de ser individuale conțin permisă în congelator de frigider la o temperatură de minus 20-40 ° C pana la studii în serie, pe o perioadă de cel mult 6 luni.

Cel mai specific și informativ (90%) este considerată a fi o reacție de imunofluorescență indirectă (RNIF). Detectarea anticorpilor la Chlamydia numai o probă de ser chiar si atunci cand titrului lor performanta de 1 / 8-1 / 16 poate indica probabilitatea curentului ca o infecție cu chlamydia și prezența urmelor de reacție asociată cu orice etiologie chlamidiale boala a migrat ultima dată. Creșterea titrului anticorpilor chlamydia 1 / 64-1 / 256 și chiar mai mare într-o singură probă de ser de la actualele forme lungi și complicate de infecție reflectă acumularea limita microorganism răspuns umoral și rezultatele corespunzătoare ale analizei clinice și epidemiologice și datele anamnestice dobândi valoare de diagnostic.

Tehnica imunofluorescență indirectă permite identificarea Chlamydia pentru a forma cu obiectele de testare corespunzătoare și titrarea seruri cu privire la anumite tipuri de agenți, de asemenea, face posibilă evaluarea conținutului serurile claselor individuale de imunoglobuline în prezența fluorescent comercial Ig M, A, G. Rezultatele negative ale testelor serologice nu exclude prezența unei infecții cu chlamydia acute sau cronice (persistente) (Ponidelko SN, 2001).

Utilizarea RNIF sinuzitei la pacientii determina anticorpi titrului Chlamydia în ser. Așa cum se utilizează preparatele antigenice preparate pe frotiurile de diapozitive mărginite de suspensii microbiene, fixate timp de 30 minute cu acetonă rece. Materialul pentru suspensiile de frotiu sunt un amestec de sac vitelin de embrioni de pui sau organe de șoareci albi infectate cu C. trachomatis, C. pneumoniae și C. psittaci.

Aceste preparate antigenice, având specificitate la nivelul genului, asigură identificarea anticorpilor Chlamydia (AT) semnificative pentru epidemiologic toate tipurile de Chlamydia. Serul de test la o diluție de 1: 2 până la 1: 256 se aplică la tampoane, sticlă, plasate într-o cameră umedă și se incubează la 37 ° C timp de 15-20 min. După expunere, materialul de testat se clătește cu apă de la robinet, apoi paharul a fost imersat în cupa cu baterie tamponată cu fosfat salin pH 7,2-7,4 și apoi se clătește cu apă distilată. După uscare la temperatura camerei pentru a provoca frotiuri luate la diluția de lucru de iepure luminescent anti-imunoglobulină umană și plasarea sticlei într-o cameră umedă, se incubează la 37 ° C timp de 15-20 min. Apoi amestecul colorat este îndepărtat, sticla se spală în soluție salină tamponată cu fosfat pH 7,2-7,4 timp de 10 minute, se clătește cu apă distilată și se usucă în aer.

Microscopia preparatelor colorate realizate cu ajutorul unui microscop cu fluorescență. Intensitatea fluorescentei specifică în formulările a fost evaluată prin scala chetyrehkrestovoy convențională (Ponidelko SN, 2001):

„++++“ - un luminos verde smarald fluorescenta in jurul EbS clar „jante“ vizibile luminoase;

„+++“ - suficient de luminoase fluorescență galben-verde culoare, „jante“ periferice ET pot fi detectate;

„++“ - o fluorescență slabă, agent patogen morfológicamente a arătat destul de clar, dar „jante“ periferice în ET abia perceptibil;

„+“ - fluorescență slabă, de culoare microscopia morfologie nedefinite obiecta perceptibil rău.

Pentru titrului diagnostician-semnificativa a anti-Chlamydia anticorpi ia diluția serică maximă care asigură o colorare specifică de cel puțin „++“. Atunci când evaluarea activității serologice seruri împotriva antigenilor chlamydia pentru primirea titruri diagnostician semnificative de 1: 8 și mai mare.

IV. Metoda de reacție în lanț a polimerazei

reacție în lanț a polimerazei (PCR) a fost descrisă pentru prima dată în 1985 și a devenit metoda standard de amplificare a ADN-ului în mai multe laboratoare de biologie moleculară. Baza tehnicii face oligonucleotide direcționate cicluri repetitive ale sintezei ADN conducând la replicarea in vitro secvențe țintă de nucleotide în. Ca rezultat, amplificarea se poate produce 1 miliard de copii ale ADN-ului țintă, care pot fi detectate fie prin electroforeză în gel sau prin hibridizare cu o sondă specifică, urmată de detectarea hibrizilor printr-un test ELISA (ELISA). PCR are o specificitate de specie și sensibilitatea ridicată la 10 molecule de ADN (Ponidelko SN, 2001).

După colectarea materialului în conformitate cu procedurile de mai sus folosind un perii speciale de unică folosință este plasat într-un eprubete sterile, 2 ml (epindorfy) preparat în prealabil în tampon (soluție de clorură de sodiu 0,9%). Material timp de 2 ore sau transportate la laborator după congelare la o temperatură de minus 18 ° C este menținută pentru o lungă perioadă de timp înainte de studiu.

Rezultatul analizei este considerat pozitiv dacă:

dimensiunea produsului ADN într-o probă clinică corespunde exact cu produsul ADN a unei probe de control;
într-o probă care conține proba clinică și standard intern, este identificat printr-un produs ADN specific al standardului intern;
într-o probă care conține apă (martor negativ) în locul probei clinice, produsul ADN-ul este detectat.

Rezultatul analizei este considerat negativ în cazul în care:

într-o probă care conține proba clinică de produse specifice de ADN nu pot fi detectate;
Rezultatele PCR în ambele probe de control produse de ADN specifice nu detectează.

Analiza a fost repetată dacă:

într-o probă, care cuprinde un ADN de control, produse de ADN specifice nu pot fi detectate;
în eșantion cu un produse intern ADN-standard specifice nu pot fi detectate și detectate de produs ADN specific în controlul negativ.

V. Metoda de cultură pentru izolarea Chlamydia

Izolarea agentului patogen la culturi celulare (CM), tratați anterior cu diverse antimetaboliți, este una dintre cele mai bune metode de diagnostic Chlamydia, așa-numitul „standard de aur“.

Materialul este luat ca metoda de imunofluorescență directă (PIF) periile speciale sterile. material prelevată este plasat în mediul de transport. Ca mediu de transport este un tampon fosfat cu zaharoză, la care se adaugă, înainte de ser bovin inactivat utilizarea căldurii la 4% din total, streptomicină 50 ug / ml amfotericină B 25 mg / ml de mediu. Material de livrare în laborator se efectuează (într-un termos cu gheață), nu mai târziu de 2 ore de la prelevare. Culturile realizate folosind culturi de celule LLC + MR2 + L929 + BHK-21C artificial rezistență scăzută. Pick up materialul este laminat pe monostraturi de culturi celulare, cultivate pe coverslips, drenat anterior mediu de creștere. Apoi, cultura de celule infectate este plasat în flacoane și se centrifughează timp de 1 h la 3000 rot. / Min, ceea ce crește numărul de incluziuni intracelulare. După centrifugare, materialul este turnat în fiole, se adaugă mediu izolator „Ac» (Eaglas MEM) cu tsiklogeksamidom la o concentrație de 2 mg / ml. Tuburile au fost incubate într-un termostat la 37 ° C timp de 48-72 ore (corespunde timpului ciclului de Chlamydia), după care lamele au fost scoase din monostrat cu tuburi, amplasate pe lamele de sticlă jos monostrat în balsamul canadian și determinarea agentului patogen de incluziune. Înainte de aceasta, fixarea și vopsirea se realizează frotiuri flyuorestsiiruyuschimi anticorpi și rezultatele evaluate după 48-72 ore prin PIF (folosind policlonale specifice și anticorpi monoclonali). La primirea rezultatelor negative, produce noi sămânță (pasaj) a materialului. Infecția a monostratului de celule și evaluarea rezultatelor se realizează prin metode standard.

Metoda de alocare de diagnosticare a Chlamydia in culturi de celule trebuie utilizată pe parcursul întregii perioade a bolii, cu excepția perioadei de tratament cu antibiotice si timp de 2-3 luni. după. Pentru controlul de vindecare, în scopul de a identifica Chlamydia viabile, care își poate exercita ciclul său de viață, această metodă este folosită după 3 luni. după încheierea tratamentului.

VI. Metoda de microscopie electronică

Pentru a forma infecția cu chlamydia persistentă diagnostic în metoda sinuzite maxilare folosind microscopie electronica. Un studiu de biopsie mucoasei nazale materiale și sinusurilor. În acest scop, secțiuni ale mucoasei imediat după gardul sunt fixate în tampon 0,1 cacodilat molar glutaraldehidă 2,5% -lea la pH 7,4 timp de 2-24 h. După spălare de trei ori în tampon cacodilat dofiksiruyutsya soluție 1% de tetraoxid de osmiu timp de 1,5-2 ore. deshidratarea se realizează în alcooli de creștere a concentrațiilor de medicament timp de 15-20 minute și rășina de impregnare sub forma unui amestec cu Epona aralditom. In concluzie, polimerizarea se efectuează într-un incubator timp de 3 zile. la 37 și 60 ° C După secțiunile semithin de polimerizare au fost preparate la 1 micron gros pe ultratome LKB-3 (Suedia). felii pătate se realizează conform metodei propuse de C. D. Humphrey, F. E. Pittman (1974), albastru de metilen, azuriu-2 și fucsină de bază pentru examinare și analiză prin microscopie optică (Ponidelko SN, 2001). În același timp, pentru a face fotografii folosind fotomicroscop «Opton» (Germania). Apoi se prepară secțiuni ultrasubțiri 3700 angstromi gros, este plasat pe dimensiunea lor ochiurilor de cupru de 200 între acestea, apoi contrastat saturată 30% soluție de etanol și citrat de plumb (Reynolds). Secțiunile au fost examinate sub un microscop electronic «JEM 100S» (Japonia), la tensiunea de accelerare de 80 kV, cu o creștere x5, x10, x30, x50 de mii de ori. Fotografie tip de film utilizat FT-41P (Rusia).

Pentru diagnosticul leziunilor chlamydia ale sinusurilor paranazale este necesar să se utilizeze algoritmul de diagnosticare speciale.

Principiul de bază al căutării de diagnostic este de trei etape.

La prima etapă a studiului de screening serul pacienților cu sinuzită pentru detectarea anticorpilor Chlamydia indică o infecție în curs prin ELISA și RNIF și verificarea speciilor Chlamydia (C. pneumoniae, C. trachomatis, C.psittaci).

În a doua etapă, prin PIF și PCR este efectuată în mod direct în diagnosticul focarele chlamidiale (cavitatea nazala si sinusurile paranazale) și leucocite din sângele periferic pentru a stabili o infecție generalizată.

În a treia etapă de diagnostic folosind CM determina agenți de sensibilitate la antibiotice.

Acest algoritm a fost testat în cadrul studiului de 97 de pacienți, inclusiv cele cu sinuzite maxilare cronice au reprezentat 28 de persoane, 39 au fost pacienți cu recurente sinuzitei acute și 30 - nu suferă de boli ale tractului respirator superior și a intrat în grupul de control. informativeness diverse metode de laborator comparative pentru diagnosticul infecției cu Chlamydia în rândul grupurilor de date prezentate în tabelul de mai studiate.

informativeness diverse metode comparative de laborator pentru diagnosticul de infectie cu Chlamydia in sinuzita

metodă	infecţia cu chlamydia
metodă	S. pneumoniae	C. trachomatis	C. psittaci	numai
Fondul mutual	59 (60,7%)
PCR	35 (36%)	8 (8,2%)	-	43 (44,3%)
KM	31 (31,9%)	11 (11,3%)	-	42 (43,2%)
RNIF	25 (25,7%)	14 (14,4%)	7 (7,2%)	46 (47,3%)

După cum se vede din datele prezentate în materialul de la pacienții diagnosticați cu anticorpi anti-chlamydia chlamydia policlonal grup specific în 59 (60,7%) pacienți. Cu toate acestea, utilizarea altor tehnici de diagnostic a permis identificarea lor completă. Când se setează aproximativ egală cu frecvența de detectare a pacienților trachomatis C. S. pneumoniae și în materialele sinuzită (PCR - 44,3% CM - 43,2%, RNIF - 40,2%).

Astfel, rezultatele studiului comparativ al metodelor de diagnostic a infecției cu Chlamydia relevat o frecvență ridicată de detecție a Chlamydia cu sinuzitei, care permite definirea „sinuzita Chlamydia etiologia“ și să identifice un număr de caracteristici clinice, caracteristice acestui grup de boli.

"Boala, leziuni si maxilo tumorale"
ed. AK Iordanishvili

Distribuiți pe rețelele sociale:

înrudit