Hematologie efecte ale noii activității p53 mutante în ciclul celular, apoptoza și sensibilitatea la citostaticelor

Încălcări ale funcției p53 sunt cel mai versatil într-o varietate de tumori persoane molekulyarnymizmeneniem. Ele pot voznikatlibo chiar si in celulele normale si creste, astfel, veroyatnostobrazovaniya clona neoplazică de ea, sau să fie celule tumorale uzhev și de a determina progrese în continuare novoobrazovaniya.Sleduet subliniază că, prin schimbarea punctelor de control kletochnogotsikla de reglare si apoptoza, disfunctie p53 modifica chuvstvitelnostkletok la medicamente impotriva cancerului.

De regulă, în tumorile relevat o mutatie missense a p53, privodyaschiek un aminoacid este înlocuit cu altul și cu cel mai mare chastotoymutatsii găsit în trei "puncte fierbinți": Kodonah175, 248 și 273. Probabil, expresia p53 mutante se ataseaza kletkedopolnitelnye avantaj selectiv asupra celulelor în care se modifică în plumb genei p53 la o alelă pierdere ekspressiipovrezhdennogo. Acest fapt poate fi explicat prin krayneymere din două motive. In primul rand, proteina mutantă are o negativnymeffektom dominantă împotriva proteinei de tip sălbatic, adică punctul mutatsiyadazhe într-una dintre cele două alele este capabil de a suprima complet ohrannuyufunktsiyu p53. În al doilea rând, în ultimii ani, există date care indică existența unor forme mutante de p53 activități nou-dobândite ("câștig de funcție"). Este cunoscut, de exemplu, că, pentru activitățile schettakih ale p53 mutante pot în mod specific și cu vysokoyaffinnostyu bind MAR / SAR ADN-elemente, remodelirovaniehromatina provocând, trans-activa promotori ai mai multor gene (myc oncogene, receptorul factorului de creștere epidermic și altele.) Și potențial uvelichivatmetastatichesky celulele tumorale. Cu toate acestea molekulyarnyeosnovy recent achiziționată și rolul lor nu este, practic, a fost studiată în procesele kantserogenezapoka.

Am încercat să analizeze impactul p53 mutante nou priobretennyhaktivnostey pe reglarea ciclului celular, apoptozai sensibilitatea la citostaticelor. Pentru a face acest lucru, am fost studiat substituții effektymutantnyh de acid p53 amino din codonii 175, 248 fiind ili273 "Spoturi fierbinți" mutații razlichnyhopuholyah la om. Noua activitate mutante p53 a fost detectată prin transductie în celule cultivate in vitro fara p53 produtsiruyuschieendogenny. Utilizarea celulelor lipsite de ekspressiyaendogennogo p53, posibil să se elimine existența dominant-negativnogoeffekta și investiga efectul de nou-dobândite numai aktivnosteytransdutsirovannogo mutante p53.

Am obținut și derivați ai celulelor umane analizate myshii p53 ekspressieyekzogennogo constitutivă sau tetraciclinrepresabil. In acest ultim caz, expresia unei r53podavlyalas mutante adăugarea de tetraciclină la mediul de cultură (1mkg / ml). 24-48 ore după subliniykletok contact de transfer obținut în mediu fără inducție tetraciclinei observat ekspressiiekzogennogo mutante p53 nu este însoțită de o creștere a ekspressiigenov țintă de tip sălbatic p53 (p21WAF1 și colab.).

Impactul noilor activități ale p53 mutante în ciclul celular rata de proliferare celulară

Activitatea mutante p53 nou dobândite determină rata suschestvennoeuvelichenie a proliferării celulare. Astfel, introducerea vectorului care exprimă în mod constitutiv mutante p53-His175, reproducere povyshaetskorost-p53 negativ murine fibroblastele linii10 (3) este de aproximativ 1,5 :. Scăderea de 23,5 ore până la 16 ore în faza de creștere logaritmică a fost observată populația celulară vremyaudvoeniya Shodnayakartina în cazul tetraciclinei reglementate ekspressiir53-His175 în linia de celule de carcinom pulmonar uman N1299ili linie fibroblast murine 10 (1), care a confirmat diferențele svyazvyyavlennyh în rata de proliferare ekspressieymutantnogo exact cu p53, și nu cu orice Modificări secundare voznikayuschimiv rezultatul selecției continue cu celule mutantnymr53 exogene. Trebuie subliniat faptul că inducerea expresiei p53 de tip sălbatic de contexte celulare nu a dus la o scădere, dar dublarea uvelicheniyuvremeni a populației de celule sau apoptoza.

Accelerarea proliferării celulelor sub influența p53 mutante nou priobretennyhaktivnostey se datoreaza, se pare, vozdeystviemna reglementarea lor ciclului celular. Analizând cinetica mechenyhmitozov apariție după adăugarea de 5-bromodeoxiuridină timp de 20 min., Noi opredelyaliprodolzhitelnost fazele individuale ale ciclului celular în creșterea logarifmicheskoyfaze. Sa constatat că includerea expresiei r53znachitelno mutante reduce timpul pentru durata scurtare schetsuschestvennogo faza S a ciclului celular. Astfel mutantnyyr53 nici un efect semnificativ asupra duratei drugihfaz ciclului celular.

dobândite recent activitatea p53 mutante, în plus față de izmeneniyregulyatsii ciclului celular în condiții fiziologice normale, pot modifica G1 checkpoint funcția activabil povrezhdayuschimivozdeystviyami. Am constatat ca inducerea expresiei celulelor mutantnogor53-His175 10 (1) și H1299 duce la faptul că-S fazuvhodit 1,5-2 ori mai multe celule cu deteriorarea ADN-ului, compus indutsirovannymialkiliruyuschim metansulfonat de etil (EMS), apoi p53 kakekspressiya sălbatic tip, dimpotrivă, reduce proporția povrezhdennyhkletok inclusă în faza S. În același timp, prakticheskine p53-His175 afecteaza activitatea punctului de control care operează în G2.

Mecanismele care le-am identificat efectele p53 aktivnosteymutantnogo nou-dobândite în reglarea ciclului celular până când neyasny.Naibolee plauzibilă este presupunerea că aceste izmeneniyasvyazany cu capacitatea de p53-His175 creste genamyc de expresie. Produsul său, așa cum este prezentat anterior, poate, pe de o parte, gena trans-activa de ornitin decarboxilaza și chemare, astfel boala, scurtarea fazei S, iar pe de alta parte activa kompleksytsiklin E Cdk2 și anula celule / oprire deteriorate în perehodeiz G1 la S .

Impactul noilor activități ale p53 mutante în inducerea apoptozei

p53 mutantă poate modifica efectul citostaticelor, numai reglarea izmenyayane G1-punctul de control, dar, de asemenea, slăbirea inducerea apoptoza.Pri acestei noi activități de act mutante p53 ca naapoptoz a provocat daune ADN-ului și a apoptozei induse de"domeniul de moarte" ("receptorii de deces") In cultura posledobavleniya medie TNF-a sau anti-Fas. Sleduetpodcherknut că astfel de efecte ale p53 mutante in stepenizavisyat mari asupra substituțiile de aminoacizi specifice, cum ar fi apoptoza și, eventual, contextul celular. Astfel, p53-His175, mult mai puternic decât p53-Trp248 sau p53-His273, inhibă apoptoza indusă de povrezhdayuschimivozdeystviyami DNA (EMC, etoposid). În același timp, p53-His273 mai puternic decât p53-His175, suprimă apoptozei Fas-induse in prostata linie de cancer chelovecheskihkletkah PC-3. Mai mult, diverse mutantnyer53 afecteaza diferentiat indus apoptoza Fasi TNF-a.

Mecanismele de acțiune ale activităților nou-dobândite în reglarea apoptozei mutantnyhr53 studiat până destul de rău. Nedavnoobnaruzheno că o modalitate de astfel de reglementare poate yavlyatsyatrans BAG1-activare a genei care codifică beloksemeystva antiapoptotic Bcl2.

Impactul noilor activități de p53 mutante in droguri chimioterapie chuvstvitelnostk

În plus față de efectele nespecifice asupra sensibilității la tsitostatikamposredstvom modificări ale reglarea ciclului celular si apoptoza, p53 mutante novyeaktivnosti poate avea mai mult sensibilitate spetsificheskoedeystvie la schimbări anumite medicamente sredstvamputem în reglementarea obiectivelor de chimioterapie. Folosind hibridizare metodsubtraktivnoy am identificat transactivare raneemisheni de acțiune necunoscut p53 mutante si a constatat ca un grup de gene activate in mod specific de gene mutante p53 include codare dezoxi-UTP-azei. hidroliză Funcția dUTFazy zaklyuchaetsyav dUTP la Dump și pirofosfat. La rândul său, pentru a forma DUMP sluzhitsubstratom dTTP de novo. Se presupune că povyshenieurovnya dUTFazy poate determina rezistenta la 5-fluorouracil, shirokoprimenyaemomu agenți chimioterapeutici al căror mecanism de acțiune prin inhibarea sintezei svyazans dTTP timidilatsintetazy.My prin suprimarea activității constatat că inducerea de p53-His175 sau p53-His248, precum si introducerea unui UTP construct care exprimă -azu, chiar și în toate culturile investigate (carcinom pulmonar H1299, rakyaichnika SKOV-3, fibroblast 10 (1) până la 1,5-2 ori mai crescut chislokletok capabile să formeze colonii după expunerea la 5-fluorouracil a.Pri aceasta rezistenta la doua medicamente diferite - adriamicină metotreksatui - nu a crescut în același timp, a p53-His273, capacitatea de a neobladayuschy trans-activa o UTP-ază gena nu uvelichivalustoychivost date de culturi celulare la 5-fluorouracil ..

Evident, există și alte căi prin care activitatea p53 mutante vnovpriobretennye influență chuvstvitelnostkletok anumitor citostaticelor. Astfel, am descoperit ca celulele vleykoznyh K562, în contrast cu celula 10 (1) și colab., Exprimarea p53-His175 determină o reducere semnificativă metotrexat chuvstvitelnostik. Exprimarea acestei rezistențe mutante uvelichivalatakzhe câteva dintre celule leucemie la noprakticheski acțiunea vinblastina nu a schimbat sensibilitatea la etoposid. În același timp, expresia p53-His273 nu a redus, ci dimpotrivă, mai multe celule povyshalachuvstvitelnost K562 la metotrexat și vinblastina. Efectele Mehanizmyetih rămân neclare.

Astfel, am constatat că aktivnostimutantnyh p53 substituții de aminoacizi nou achiziționate de la pozițiile diferite razlichnymobrazom afectează sensibilitatea la diferite medicamente chimioterapie. Prietom poate diferi nu numai efectele diferitelor apă mutante p53 și același tip de celulă, dar, de asemenea, acțiunea acelorași celule mutantav de diferite origini. Toate acestea sunt necesare uchityvatpri încercările în curs de desfășurare ispolzovatmutatsii p53 pentru a prezice rezultatele chimioterapiei împotriva cancerului.