Animale transgenice: tehnologia

Video: Bioseminars.ru: Egor Malashichev - Animale transgenice și Embriologie comparativă

Spre deosebire de plante, în cazul în care există posibilitatea obținerii unei plante fertile dintr-un celule somatice transformate și clonarea, producția de animale transgenice - un proces foarte dificil și de lungă durată.

Strategia utilizată este următoarea:
1. Gena donată este introdusă într-un nucleu ovulului fertilizat.
2. ovulului fertilizat cu ADN-ul exogen sunt implantate într-o femelă recipient (după finalizarea cu succes a embrionilor de mamifere, în alte circumstanțe imposibile).
3. Bleed descendenți dezvoltat din ouă implantate care conțin gena clonată în toate celulele.
4. animalele skew care transporta gena clonată în celule ale liniei germinale si da noua linie genetică.

Experimentele asupra organismelor multicelulare modificate genetic prin introducerea transgenelor în ele necesită o mulțime de timp. Cu toate acestea, transgenic deveni un instrument puternic pentru studiul bazelor moleculare ale expresiei genelor de mamifere și de dezvoltare, pentru a crea sisteme de model, care sa permita studiul bolilor umane, precum și modificarea genetică a glandelor mamare ale celulelor de animale pentru a produce proteine din lapte de importante pentru medicina. A existat chiar și un termen nou „pharming» (pharming), referindu-se la procesul de preparare a laptelui de animale transgenice proteine umane autentice sau farmaceutice.

Utilizarea de lapte este de folos, deoarece este format în corpul animalului în număr mare și poate nadaivat după cum este necesar, fără a afecta animalului. Produs de glanda mamară și secretat în laptele nu este o proteină nouă trebuie astfel să exercite efecte adverse asupra proceselor fiziologice normale la animal transgenic, și supus schimbărilor post-translațională, care, cel puțin apropiate de cele din celulele umane. În plus, izolarea sa din lapte, care conține alte proteine, nu trebuie să fie prea dificil.

În ciuda faptului că primul animal transgenic au fost obținute în 1985 introducerea de ADN exogen în zigoți pronuclear nu a dezvoltat încă o metodă eficientă, care ar putea fi utilizate pentru a crea animale modificate genetic, indiferent de tipul și scopul experimentului. Dezvoltarea de noi metode eficiente de transfer de gene în celule embrionare și somatice ale animalelor, precum și îmbunătățirea abordărilor existente este o sarcină urgentă.

Printre marea varietate de metode de introducere a ADN-ului exogen în genomul animal pot fi distinse, care sunt utilizate pe scară largă în practica transgenice:
- Metoda microinjecție,
- retrovirus mediat transferul de gene,
- modifitsirovanngh utilizarea celulelor stem embrionare,
- transfer de nuclee transformate generative și celule somatice
- utilizarea și spermatozoizii spermatogonia ca vectori de ADN.

Printre alte metode de administrare a ADN-ului exogen într-un organism de animale poate nota utilizarea lipozomilor, vectori adenovirali, precum și metoda de injecție de mare viteză. Cu toate acestea, aceste metode nu sunt utilizate pe scară largă datorită stabilității lor insuficientă și lipsa de integrare a transgenei în genomul.

Microinjection a ADN-ului recombinant în ovocite fertilizate de animale multicelulare sunt în continuare cel mai popular mod de a introduce gene străine în animale. În ciuda faptului că această metodă necesită o calificare înaltă și echipamente scumpe, simplitatea și fiabilitatea sunt de plată toate neajunsurile sale.

Primul și cel mai bine stabilit sistemul experimental pentru producerea de animale transgenice a fost șoarece. Donor șoareci femele cu superovulatia experimental imperecheate cu masculi care produc, după 12 ore a fost izolat ouă fertilizate și plasate în cultură. Mai mult, cea mai mare dintre cele două pronuclei (de obicei, masculul) au fost injectați cu un ADN recombinant (fig. 2.17). Supraviețuitorii injectat ou este transplantat într-o femelă destinatar. Numai o parte a ovocitelor transplantate au continuat să se dezvolte până la fatare.

Fig. 2.17. Microinjection a ADN-ului exogen în pronucleul ovulelor mamifere fertilizat sub microscop (a) și configurația experimentală (B)

Frecvența integrării ADN-ului exogen folosind metoda microinjectare este influențată de factori cum ar fi puritatea injectarea probei, forma și concentrația ADN-ului, compoziția soluției tampon pentru microinjecția, calitatea embrionului, și o metodă de recipient de transfer de embrioni (nechirurgical, chirurgical, laparoscopic).

animalele transgenice sunt identificate în descendența o varietate de metode, cele mai multe dintre PCR și cuplat pentru a obține linii transgenice. Unele dintre animalele transgenice sunt mozaic (celule embrionare nu conțin ADN exogen) prin trecerea transgenic, prin urmare, este o parte mai mică din prima generație de urmași decât calculat 50%. În unele cazuri, liniile homozigote nu pot fi obținute datorită inserțiilor transgenice 5-15% homozigota letale, deoarece inserția încalcă uneori părțile vitale ale genomului.

Mecanismul exact pentru integrarea ADN-ului injectat in cromozomii celulelor țintă nu este cunoscută, dar analiza structurilor ADN inserate dezvăluie anumite puncte. Integrarea are loc la întâmplare, la un locus cromozomial, care poate conține una până la mai multe mii de copii în tandem ale ADN-ului integrat. Aproximativ 30% dintre animale transgenice primare obținute, de obicei, prezintă un anumit grad de mozaic, care poate rezulta din integrarea replicarea ADN-ului exogen, după primul ciclu.

Gradul de integrare a ADN-ului exogen în genom, adică, numărul de animale transgenice din totalul numărului născut animale folosind metoda microinjectare, în funcție de specie variază într-un interval mic de 5-15%. Cel mai important având în vedere costul necesar pentru a produce un animal transgenic este transgenic indice de eficiență globală, care se calculează ca raportul dintre animal transgenic obținut din numărul total de embrioni transplantat, exprimat în procente. Valoarea acestui indice pentru mamifere este de asemenea relativ constantă la o medie de ~ 0,5% pentru porci și vaci până la aproximativ 2% la șoareci.

Vectorii retrovirali sunt de asemenea folosite pentru a genera animale transgenice. Infecția embrionilor preimplantare cu retrovirusuri recombinante - o procedură eficientă relativ simplă.

Vosmikletochnuyu morula (Fig. 2.18) eliberat din coajă de ou și plasat într-un vas de cultură cu fibroblastele produc retrovirus recombinant. embrioni Infected a ajuns la stadiul de blastula au fost implantate in femele pseudoînsămânțare. Ca urmare, organismele transgenice sunt generate, mozaicuri în funcție de numărul și locația de built-in ADN-ului recombinant în genom. Prin urmare, pentru a obține linii pure necesită în continuare o outbreeding pe scară largă.

Un dezavantaj al metodei este de a limita inserția bunurilor ADN ~ 8 consumatori exogene, în care transgena poate fi lipsit de secvențe reglatorii adiacente necesare pentru exprimarea sa, iar în unele cazuri, să integreze în locusul originală instabil.

Noii vectori lentivirali (lentiviruses aparțin familiei retrovirusurilor) au demonstrat eficiența foarte mare în livrarea de ADN în ovocite și zigoți. Injectarea constructelor lentiviral recombinante în spațiul perivitelline de zigoți porcine și ovocite de bovine ca rezultat apariția progeniturii cu cele mai mari lobi în prezent de animale transgenice. În același timp, vectori lentivirali au toate dezavantajele retrovirale: inserarea dimensiunii mici a ADN-ului exogen și integrare multiplă în genomul gazdă, care poate duce la efecte secundare nedorite, cum ar fi activarea oncogenelor și mutageneza insertionala. Mai mult, vectorii lentivirali pentru un grad ridicat de progenituri transgenice mozaic produs și a faptelor individuale de atenuare a zgomotului (inactivare) secvențelor lentivirali recombinante obținute linii transgenice.

Utilizarea vectorilor retrovirali are un mare dezavantaj. Cu toate că acești vectori sunt create astfel încât acestea sunt cu replicare deficientă tulpina retrovirus genomului (virus helper), care este necesară pentru a obține cantități mari de ADN vector poate cădea în același miez ca transgenă. În ciuda tuturor măsurilor luate, ajutoare retrovirusuri poate fi replicat în animalul transgenic, care este absolut inacceptabil, în cazul în care aceste animale să fie folosite ca aliment sau ca un instrument pentru a obține un produs comercial. Și, din moment ce există metode alternative de transgeneză, vectori retrovirali sunt rareori folosite pentru a genera animale transgenice, care au o valoare comercială.

Fig. 2.18. Schema de obținere a liniilor de șoareci transgenici utilizând vectori retrovirali

Cele modificate celule stem embrionare pot fi utilizate pentru obținerea de animale transgenice. Celulele izolate din embrioni murine în stadiul de blastocist, pot prolifera în cultură, menținând în același timp capacitatea de a se diferenția în orice tipuri de celule, inclusiv celulele liniei germinale, atunci când sunt administrați într-un alt embrion la stadiul de blastocist (fig. 2.19).

Astfel de celule sunt numite celule pluripotente stem embrionare (ES). ES-celulele din cultura pot introduce tinta transgenică tehnici diferite (transfecție, electroporare, infecție retrovirală, etc.) fără a perturba pluripotența lor. Avantajul practic al acestui sistem este că oferă o mare oportunitate pentru selecția celulelor de către un anumit parametru. Acest lucru poate fi numărul de copii ale transgenei, modelele sale de localizare sau expresie.

Cunoașterea secvenței din jurul unui sit specific pentru integrarea dorită, puteți construi un vector pentru inserția ADN-ului țintă prin recombinare omologă. De exemplu, înlocuiți o genă care codifică o indicație ușor de identificat în scopul selectării prin eliminarea lui sau restabilirea functiei in celula transgenic rezultat.

În același mod, așa-numitele soareci knock-out (knock out) - soareci cu gena celulara direcțională specific inactivat pentru a studia funcția. Pentru a realiza un vector de recombinare omoloagă este construit din fragmentele genei țintă, care este programat pentru a inactiva o porțiune a genei țintă este apoi înlocuit cu un marker de selecție pentru selecția celulelor cu un design integrat.

Fig. 2.19. Prepararea șoarecilor transgenici prin reconstrucție a embrionilor folosind modificate genetic celule stem embrionare (ES-celule). ES-celule sunt derivate din masa celulară internă a unui blastocist șoarece

transgenice ES-celule selectate pot fi cultivate și utilizate pentru producerea de animale transgenice. Acest lucru împiedică introducerea accidentală a unei transgene, care este caracteristică pentru metoda și microinjectare sistemelor vector retroviral.

Toți au primit în mozaic schemei sunt animalele de reproducție de muncă atât de necesare pentru a obține linii pure. problemă primar animale transgenice de mozaic pot fi depășite prin transplantarea nuclee transformate ES-celule in oocite enucleated care au fost apoi continuat dezvoltarea normală. Ca rezultat, în fiecare celulă a unui animal obținut va conține transgena.

Din păcate, ES-celule pluripotente, similar cu un mouse, până când în alte mamifere și păsări, dar căutarea continuă.

transferul nuclear de celule somatice și generative transformate într-un ou sau transfer nuclear somatic (transfer nuclear somatic), o altă metodă utilizată în practica transgenesis. Sa demonstrat că nucleul celulelor embrionare ale diferitelor animale atunci când sunt transferate la un ou denucleat uneori în măsură să asigure dezvoltarea unui nou organism. După o cultivare de scurtă durată, chiar în centrul unora dintre celule diferențiate sunt capabile să asigure dezvoltarea unui individ viabil.

De exemplu, celebrul oaia Dolly a fost donată în 1997 a fuziunii cultivate (3-6 treceri) epiteliale de san celule (uger) adult animal cu nucleu șase ani lipsit ovulului (fig. 2.20). Deși nu putem exclude posibilitatea ca clonare a fost luată în mod accidental celule nediferentiate prezente în epiteliul donator.

Fig. 2.20. Clonarea oilor prin transfer nuclear. Celulele epiteliale mamare în cultură este indusă pentru a intra în faza G0 (etapa pe care oul). Apoi, fuziunea acestor celule cu ovocitul denucleat și embrionii sunt crescute la primele stadii ale embriogenezei. După care embrionii sunt implantate în uterul unei mame surogat, în cazul în care are loc dezvoltarea în continuare. In experiment, J. Wilmut (I. Wilmut) Clonarea a fost realizată Dolly 277 M ova enucleated cu celule mamare în faza G0 a 29 de embrioni care au supraviețuit dezvoltate la un singur organism viabil

Dolly Clonarea unui nucleu de celule diferențiate și celelalte trei oi din nuclee de celule embrionare ar putea pune în aplicare prin transferul nuclee de celule care se află în faza de repaus (G0), și, eventual, caracteristicile embriogenezei animal. În zygotes ovine în primele trei divizii, ocupând câteva zile, numai pentru a se produce replicarea ADN-ului, nici unul dintre gena nu este exprimată. Se presupune că în acest timp ADN-ul introdus este eliberat din celule specifice proteine de reglementare și genele corespunzătoare sunt asociate cu dezvoltarea embrionară embrionare factori proteici inițiator din citoplasmă ovulului.

In timp ce tehnologiile de donare sunt încă foarte departe de perfecțiune - clonată Dolly dezvaluie multe semne de imbatranire prematura, este o tehnologie foarte promițătoare pentru producerea de animale transgenice. Chiar dacă există mai multe probleme cu prima generație, cel mai probabil, a doua generație nu va avea dezavantaje, obținute prin utilizarea de „vechi“ pentru nucleul de ou.

Principala problemă care trebuie rezolvată, în scopul de a crea orice animale transgenice utilizând metoda de transfer nuclear a fost real, - este conservarea celulelor pluripotente în cultură continuă. În prezent, fiind activ caută factori reprogramarea celulelor diferențiate pentru a induce pluripotența. Dacă reușește, modificarea genetică a acestor celule și crearea de organisme transgenice prin transfer nuclear somatic va deveni aproape o procedură de rutină, și în timp ce acestea sunt izolate experimente de succes.

cromozomi artificiali ca un vector transgene. Cele mai multe transgene sunt gene mici (ADNc<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в обычные векторы.

Având în vedere toate acestea, utilizarea oțelului pentru drojdii transgenice cromozom artificial (YAC), care include fragmente de ADN genomic de lungime de 100 > 1000 bunuri de larg consum și cromozomi artificiali chiar mai mare capacitate (aproximativ cromozomi artificiali). Acești vectori episomali au un alt avantaj - evită expresia genelor efect de poziție atunci când ADN-ul exogen. Nivelul de expresie al genei inserate este foarte dependentă de poziția sa cromozomală, de exemplu, încorporarea cromatinei inactive (heterocromatină) cromozom intact conduce la inactivarea genei.

Folosind drojdie cromozom artificial (YAC), care transportă mai multe gene înrudite sau o gena mare, șoarecii transgenici au fost generate de microinjecție în pronucleul unui ou fertilizat, sau prin transfecția ES-celule. Șoarecii transgenici care transportă un grup de cinci globinei umane funcționale genovv lungime totală de aproximativ 250 de bunuri de consum, toate aceste gene sunt exprimate în mod specific de țesut și la momentul potrivit Exact în același mod ca și la oameni. O astfel de respectare a fost asigurată secvențele lor de flancare care conțin un promotor și alte elemente de reglementare importante. Folosind șoareci YAC-transgenici au fost obținute care sintetizați numai anticorpii umani sunt structuri complexe tetramerică a două perechi de lanțuri polipeptidice diferite.

cromozomi umani artificiali (umane -HAC cromozom artificial), care conțin întreaga locus de imunoglobulină umană cu lanțuri grele și ușoare au fost introduse în fibroblastele de bovine, care sunt apoi utilizate pentru transferul nuclear somatice. vițeii transkhromosomalnye primite exprimă imunoglobulină umană în sângele lor. Acest sistem a fost un pas important în direcția producției animale de anticorpi policlonali umani terapeutici.

observație suplimentară a animalelor transgenice au arătat că HACs recombinante au fost menținute în majoritatea primei generații de persoane pe parcursul mai multor ani. Indiferent dacă sunt sau nu au primit cromozomi artificiali pentru a separa în mod corespunzător în timpul meiozei și moștenite, rămâne de văzut.

Mai recent, o nouă tehnologie promițătoare pentru animale cu gene cu dizabilități - mici de interferenta ARN (siRNA, siARN), care sunt utilizate pentru oprirea genelor cu scopul (silencing). interferenta ARN - un proces de reglementare conservator post-transcripțional. Dublu catenar mici de interferență ARNsi în 19-23 de nucleotide se leagă în mod specific la secvența sa complementară a șablonului ARNm țintă, direcționarea lui de-a lungul degradării calea.

interferenta ARN-ul este o parte a sistemului de reglare a genei, și anume controale / suprimă translația ARNm-ului elementelor virale endogene și exogene și pot fi utilizate în scopuri terapeutice. Pentru tranzitorie sintetic de oprire a genei siARN au fost transfectate în celule sau embrioni timpurii. Pentru represiune gena stabilă secvență siARN trebuie încorporată în genomul ca parte a unui construct de gene expresie.

combinație foarte eficientă de vectori lentivirali cu siARN pentru integrare în genom. Spre deosebire de strategia clasică knock-out, care necesită o linii de reproducere lungi pentru a obține gena pur inactivat in ambele loci genomului diploid siARN Integration poate transforma cu ușurință de gena țintă în orice linie disponibilă animal.

In ciuda gama larga de tehnici dezvoltate pentru producerea de animale transgenice, până în prezent nici o tehnologie fiabilă și eficientă pentru animale transgenice. Cele mai mari probleme sunt legate de inserția de ADN exogen aleator în genom cu majoritatea metodelor existente. Deci, această tehnologie îmbunătățire suplimentară a calității necesare pentru dezvoltarea reperare modificarea genelor celulare și inserarea corectă a ADN-ului exogen în genom.

Mai mult faptul că majoritatea de gene de organisme importante punct de vedere economic de acum complet ordonate si poate planifica structura viitoare a organismului transgenic. Combinatia de secvente genomului complet decodate cu metodele de livrare direcționată a ADN exogen va permite construirea de genomuri transgenice orientate cu proprietăți predeterminate.

NA Warriors, TG Volova

Distribuiți pe rețelele sociale:

înrudit