Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.

Moscova, Centrul Federal de Stat sanitaro-epidemiologică Ministerul Sănătății 2000UtverzhdayuGlavny gosudarstvennyysanitarny vrachRossiyskoy FederatsiiG.G.ONISchENKO24 aprilie 2000 godaData iulie 2000 vvedeniya1 goda2.3.2. Alimente și DOBAVKIMEDIKO alimentară - Evaluarea biologică a produselor alimentare derivate din genetic MODIFITSIROVANNYHISTOCHNIKOVMETODICHESKIE UKAZANIYAMUK 2.3.2.970-001. Dezvoltat de Institutul de Nutritie (Tutelian VA -cap, Aksyuk IN, Vasiliev AV, Vorobiev LS, VysotskiyV.G., Volgarev MN, Korolev AA, Kravchenko L . .żn, Maganova NB, Mazo VK, Pokrovskaya GR, Sokol'nikov AA, Sorokin EY, TyshkoN.V). - vaccinuri și seruri Institute. II Mechnikov Stiinte Medicale (Semenov BF, Britsina MV, Zakharova NS.) - (. GG Onișcenko, Petuhov AI) Ministerstvomzdravoohraneniya RF (Departamentul de Inspecție Sanitară) - Moscova Medical Academy. IM SechenovaMinzdrava Rusia (butoaie NP, Sukhanov bp.) - Centrul"Bioinginerie" RAS (Scriabin KG, Kuznetsov BB, Dorokhov DB, Asadov UE.) - Medical - Centrul genetic al RAMS (Shishkin, SS.) - Moscova Universitatea de Stat din Aplicate biotehnologiiMinisterstva RossiyskoyFederatsii de învățământ general și profesional (Rogov IA, austeră NG Gurova N., VV noduri.). 2. Aprobat 20 aprilie 2000, a adoptat Glavnymgosudarstvennym medicul sanitar al Federației Ruse din 1 iulie 2000g.3. Vpervye.1 introdus. Dispoziții generale și primeneniya1.1 domeniul de aplicare. orientări metodologice stabilite trebovaniyakprovedeniyu medicale - studii biologice de produse alimentare derivate din istochnikov.1.2 modificate genetic. Liniile directoare sunt destinate să uchrezhdeniysanitarno - epidemiologic al Federației Ruse, care efectuează sanitar de stat - epidemiologicheskiynadzor, precum și alte instituții acreditate de lucru naprovedenie în acest oblasti.1.3. Cerințele prezentei ukazaniyahv metodologice pentru produsele derivate din genetic modifitsirovannyhistochnikov se aplică în etapa de producție, examinarea de igienă, înregistrarea de stat, achiziționarea, importul în țară și realizatsii.1.4. orientări metodologice sunt destinate obespecheniyaedinogo, știință - bazată pe metoda de evaluare a calitatii produselor alimentare ibezopasnosti derivate din surse geneticheskimodifitsirovannyh, stadii de dezvoltare, examinarea produktsii.1.5 de înregistrare igosudarstvennoy. Producătorul noilor produse alimentare derivate izgeneticheski modificate surse destinate dlyarealizatsii pe teritoriul Federației Ruse ar trebui să emită eemarkirovannoy în conformitate cu poryadkom.2 stabilită. ssylki2.1 Normativ. legea federală "Pe sanitar - populația epidemiologicheskomblagopoluchii" din 30 martie 1999 D.2.2. "Bazele legislației Federației Ruse asupra cetățenilor ohranezdorovya" din 22 iulie 1993 g.2.3. legea federală "Cu privire la modificările și completările la Federația Rusă vZakon "Protecția consumatorului" și KodeksRSFSR contravențiilor administrative" pe 09 ianuarie 1996 D.2.4. Regulamentul privind reglementarea sanitaro-epidemiologică de stat, aprobat de către Federația Rusă PostanovleniemPravitelstva pe 05 iunie 1994 N 625.2.5. Reglementările privind serviciul sanitar și epidemiologic de stat al Federației Ruse, utverzhdennoePostanovleniem Guvernul rus din 30 iulie 1998. N 680.2.6. Rezoluția șef sanitar de stat vrachaRossiyskoy Federației N 7 din 06 aprilie 1999 "Despre evaluarea poryadkegigienicheskoy și înregistrarea producției de alimente, poluchennoyiz surse modificate genetic".3. Termeni si produse opredeleniyaPischevaya - materii prime alimentare, produktyi alimentară komponenty.Prodovolstvennoe materiile prime - obiecte de origine biologică, organică și anorganică dlyaproizvodstva produktov.Pischevoy -produktzhivotnogo produs alimentar, vegetale, minerale sau origine biosintetice, prednaznachennyydlya consumului uman, atât în ​​volum și vpererabotannom vide.Komponent - substanță animală, vegetală, origine microbiană ilimineralnogo și p sintezirovannyepischevye rirodnye sau aditivi utilizați în produsul preparat sau proizvodstvepischevogo sau sunt prezente în produsul finit în produsele alimentare modificate vide.Kachestvo iskhodnomili - un set de caracteristici care determină proprietățile de consum, produse alimentare de calitate ibezopasnost produse alimentare produktsii.Bezopasnost - nu există nici un dlyazhizni pericol și sănătatea prezente și viitor pokoleniy.Gennaya Inginerie - sectiunea de genetica moleculara asociate crearea de noi stselenapravlennym în vit0ro com Inácio geneticheskogomateriala (ADN recombinant) capabil să reproducă ifunktsionirovaniyu celulei - hozyaine.Geneticheski organism modificat - neskolkoorganizmov sau organismului, orice kvosproizvodstvuiliperedachenasledstvennogo material genetic noncellular, unicelular sau mnogokletochnyeobrazovaniya capabile diferite de prirodnyhorganizmov obținute folosind metode de inginerie genetică isoderzhaschie genetic - inginerie materiale, inclusiv gene, fragmente ale acestora, sau o combinație genov.4. Procedura de înregistrare de stat ekspertizyi igienică a produselor alimentare derivate din modifitsirovannyhistochnikov4.1 genetic. Toate produsele alimentare derivate din surse geneticheskimodifitsirovannyh trece de examinare de igienă poryadke.4.2 instalate. Efectuarea de examinare gosudarstvennoyregistratsii și alimentare produse de igienă preparate din surse geneticheskimodifitsirovannyh se face conform sporyadkom, Federația Rusă set Rezoluție principal medic gosudarstvennogosanitarnogo de la 7 06/04/99 N "Despre evaluarea poryadkegigienicheskoy și înregistrarea producției de alimente, poluchennoyiz surse modificate genetic".4.3. Organizațiile, companiile sunt la centrul de normalizare sanitar-epidemiologice, certificarea igienică iekspertizy Ministerul Sănătății al documentelor și materialelor Rusă Federatsiikomplekt, printre care: - cerere (scrisoare) pentru a efectua o cerere de înregistrare evaluare igosudarstvennoy igienică a produselor alimentare derivate izgeneticheski modificat materiale istochnikov-- care reflectă medicale - genetice estimarea pischevoyproduktsii obținute din materiale istochnikov-- modificate genetic care reflectă tehnologic Proprietățile skie pischevoyproduktsii obținute din materiale modificate genetic istochnikov-- reflectă medical - biologică pischevoyproduktsii evaluare obținută din istochnikov.4.4 modificată genetic. Volumul și programul de lucru privind evaluarea calității produselor alimentare ibezopasnosti derivate din geneticheskimodifitsirovannyhistochnikov determinate de rezultatamekspertizy prezentate materialov.4.5. Activitatea privind evaluarea calității și a produselor derivate din bezopasnostipischevyh genetic modifitsirovannyhistochnikov, firma - producătorul oferă mostre de produs, vkolichestve dlyaprovedeniyapolnogoobemaissledovaniy.4.6 necesar. Pe baza examinării cu condiția ca documentele imaterialov și rezultatele medico - genetice, tehnologice și medicale - biologice produktsiitsentr cercetare sanitare - norme epidemiologice, gigienicheskoysertifikatsii și expertiza Ministerul rus al Sănătății pregătește blankregistratsionnogo certificat (sau un aviz obotkaze motivat) și transmite la semnarea Departamentului gossanepidnadzoraMinzdrava Rusia. Înregistrarea de stat Certificat podpisyvaetsyaGlavnym medicul sanitar al Federației Ruse, absența AB - șef de stat sanitar-Departamentul epidemiologice, adjunct șef gosudarstvennogosanitarnogovrachaRossiyskoy Federatsii.5. Medico - evaluarea genetică a produselor alimentare derivate din genetic modifitsirovannyhistochnikovNeobhodimost efectua orice cercetare asupra dannomurazdelu pentru fiecare tip specific de hrană, poluchennoyizgeneticheskimodifitsirovannyhistochnikov determinat de un centru expert "Bioinginerie" Academia rusă de Științe. Tehnicile descrise la punctele 5.1 - 5.3 sunt necesare medicale priprovedenii - kakdopolnitelnye.5.1 evaluarea genetică a produselor alimentare derivate din metodele istochnikov- modificate genetic prezentate în articolul 5.4, poate fi recomandată. echipamente RAPD genotipovNeobhodimoe analiză și de tip tuburi Eppendorf reaktivyOborudovanie și prinadlezhnostiMikrotsentrifuzhnye și 1,5 ml de 0,5 (disponibil de la DNA-ază azei-ARN firma Alpha) mojarul teflon și / sau baghetă de sticlă sub tuburi razmermikrotsentrifuzhnoy 1,5 ml *>Tip Tabelul microcentrifugă Eppendorf (THETA 20 200000ob. / min.) *>Automată micropipete volum variabil (Classic / student 0.5-10 mkl- 5-40 mkl- 2-100 L) pentru micropipete sfaturi (sfat "micro" și convenționale) Frigider (răcitor probă) *>Trepied plutitoare - "plută" probirokVesy microcentrifugă de 0,5 kgMikroanklav - "Presiune plite"BidistillyatorDNK-cycler ("Amplitudinea-4") Echipamente de separare fragmente DNKv prin electroforeză la electroforeză pe gel de agaroză: o sursă de tensiune pentru electroforeză (NPC 300) *> și un dispozitiv pentru mini orizontal - electroforeză (mini-camera) *>iluminator UV pentru a vizualiza rezultatele ADN electroforetice (transiluminator - UVT) *>Tip SLR "zenit" Tip orange svetofiltromFotoplenka "Mikrat-200"(termostat"Temo 24-15") Shaker (3D) tip Mikrovstryahivatel Tuburi Vortex (THETA 2 sau 4) *>RN-metrFitotron cultivarea (fitotron-99) Tabelul cutie laminară (BL-1) ------------------------------- - *> Desemnarea produselor, care sunt fabricate pe companie"Biokom", Moscova, reactivi Rossiya.Neobhodimye și rastvoryReaktivyTris (hidroximetil) alcool aminometaneHCl konts.EDTANaClSDSAtsetat kaliyaEtilovy 96% Agarose pentru elektroforezaBromisty etidiyBornaya kislotaBromfenolovy siniyGlitserinNabor pentru amplificarea ADN-ului (Biomaster - Srl - Italia - Rusia, Moscova) Prepararea rastvorov1 principal M Tris pH 7,5 . Se dizolvă 121,1 g TRIS în 800 ml vody.Dovesti pH la valoarea dorită prin adăugarea kontsentrirovannoyHCl și aduce volumul la 1 litru. O soluție prosterilizovat.0,5 M EDTA pH 8,0. La 186,1 g de EDTA se adaugă 800 ml vody.Dovesti pH la 8,0 M NaCl NaOH.5 (grad reactiv sau de puritate analitică). 29,22 g de clorură de sodiu dizolvată în 80 ml de apă și se aduce volumul la 100 ml, prosterilizovat.10 procente SDS. Se dizolvă 10 g de SDS în 90 ml de apă, dizolvarea chtobyuskorit, soluția poate fi încălzită la 60 ° C. C. DovestipH la 7.2 prin adăugarea câtorva picături de idovesti HCl concentrat la 100 ml. Atenție! La cântărirea SDS litsomasku pune pe, deoarece în contact cu mucoasa a pulberii etotletuchy nazofaringelui este foarte tampon razdrazhenie.Ekstraktsionny (200 mM Tris-HCI pH 7,5, 250 mM NaCI, 25 mM EDTA, 0,5 procente SDS). Pentru a prepara 100 mlekstraktsionnogo tampon necesită 20 ml de 1 M Tris-HCI (pH 7,5), 5 ml M NaCI, 5 ml de 0,5 M EDTA și 5 ml de 10 procente SDS. Se aduce soluția la 100 vodoyobem ml.5 M acetat de potasiu. 49,1 g de acetat de potasiu dizolvat în 80 ml de apă pentru a aduce volumul la 100 ml.70 procente etanol. Pentru a prepara 100 ml rastvoratrebuetsya 73 ml de etanol 96% și 27 ml de tampon vody.TVE 5X (0,089 M Tris - bază bornayakislota 0,089 M, 0,002 M EDTA pH 8,0). La 1 litru de soluție necesară 54 g TRIS, 27,5 g acid boric (analitic pur), 4,6 g Na2EDTAx2H20. tampon Dlyaprigotovleniya electrod-0,5x TBE trebuie stokovyybufer diluat de 10 ori cu vodoy.Bufer distilat pentru aplicarea probei-6X (procente 0,25-bromfenolovyysiny, 30 procente glicerol, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA). Dlyaprigotovleniya 10 g tampon de încărcare necesită 2,5 mgbromfenolovogo albastru, 3 g de glicerol, 0,1 ml de Tris, 0,02 ml de 0,5 MEDTA pH-8,0.Rastvor bromură de etidiu (10 mg / ml). Se dizolvă 1 gbromistogo etidiu 100 ml de apă. Pentru vizualizarea ADN-ului în soluție utilizată agaroznomgele la o concentrație de 5 ug / ml. Atenție! Vsemanipulyatsii cu bromură de etidiu și soluția de ADN pentru a efectua vperchatkah.Vydelenie tkaniDlya din țesutul plantelor producătoare de semințe de plante, tuberculi sau material de drugoyrastitelny germinate în condiții controlate dopolucheniya frunze proaspete sau plantă foaie tkani.Vysechku obținute prin închiderea capacului tipaEppendorf tuburi de 1,5 ml sau 10 - 14 mg de țesut (când vysechkupoluchit dificil) v400mlekstraktsionnogo tampon intensiv omogenizate (soluții și reactivi necesare) cu pomoschyuteflonovogo pestika.Primechanie. Pentru a izola ADN-ul este mai bine să ia frunzele tinere smyagkimi țesuturi fără urme vizibile de distrugere. Teflon pestikdolzhen aderă la pereții tuburilor. Încercați timpul de omogenizare maksimalnominimizirovat. Omogenizarea plumb dointensivnogo colorare extracție verde bufera.Probirki cu Shake omogenat timp de 5 secunde. pe Vortex.Pomestit ultratermostat tuburi și se incubează la 65grad. C 15 min., Conținutul Amestecă periodic pokachivaniem.Dobavit probirkimyagkim în eprubete în 200 pl de 5 M acetat de potasiu (răcită în prealabil la frigider) conținutul tuburilor de testare și tschatelnoperemeshat probă vstryahivaniem.Inkubirovat lumină într-o baie de gheață pentru proba 15 min.Tsentrifugirovat într-o centrifugă de masă superioară la 16000 g 20min. la cameră temperature.Ostorozhno selectați 400 ui de supernatant în tuburi proaspete iosadit două volume de etanol 96 procente (răcite) prin agitare ușoară. În acest moment, puteți observa obrazovaniemalenkoy "meduză" sau dispersată fin suspensie. Lăsați probirkina tabel 5 probe min.Tsentrifugirovat într-o centrifugă BenchTop la 16000 g, 10min. la sala DNA temperature.Osadok clătire răcită la -20 ° C. C-70 protsentnymetanolom și centrifugate așa cum este descris în repetarea punkte.Rekomenduem anterior această procedură o dată raz.Slit supernatant și utilizarea mikropipetkimaksimalno elimina reziduurile lichide din ADN-ul probirki.Osadki uscat prin deschiderea capacului probirok.Primechanie. Ai grija sa nu overdry precipitarea ADN, t.k.peresyhanie ADN conduce la o slabă solubilitate în ADN vode.Rastvorit în 100 l redistilată concentrație ideionizirovannoy vody.Izmerit ADN genomic DNK.Amplifikatsiya genomic DNKAmplifikatsiyu steril este realizată într-un amestec de reacție de 25 pl (67 mM Tris-HCI unități de pH-8,8- 16 mM (NH4) 2SO4- 2 mM MgCl2- 0,01% Tween-20- 200 mM / ml 25 ADN mkggenomnoy fiecare dNTP- 22 praymera- și 0,5. Taq-polimerază) . Toate componentele, cu excepția ADN-ul inclus în kit-ul pentru companie amplificare Biomaster.Sterilnye tub de tip Eppendorf de 0,5 ml și plasate vshtativ podpisat.V unul din tuburi pentru a forma reaktsionnuyusmes adăugarea secvențială a componentelor, așa cum este indicat în desen amestecul de reacție primere.Primer + ------------------------------ + ------------------ + -------------- + | Ingrediente | Într-o singură probă, l | Pe 7 probe l | + ------------------------------ + ---- -------------- + -------------- + | H2O | 16,8 | 117,6 | + ------------------------------ + ---------- -------- + -------------- + | tampon de reacție fără | | || MgCI2 (10X) | 2.5 | 17,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- + -------------- + | MgCI2 | 1 | 7 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | A | dNTP`s amestec 2 | 14 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | Primer (4 AU / ml) | 0,5 | 3,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- + -------------- + | ADN polimerază termostabilă | 0,2 | 1,4 || (4 U / ml) | | | + ------------------------------ + ----------------- - + -------------- + | ADN-ul | 2 | - | + ------------------------------ + ---------------- - + + -------------- Se diluează amestecul de reacție în tuburile respective probirkam.Vnesti ADN-ul genomic și cu atenție pipetată dlyaperemeshivaniya proby.Poverh reaktsionnoysmesinasloitneskolkokapelmineralnogo ulei (aproximativ 17 pl) făcând îndepărtarea bule de aer tuburi vtechenie secunde centrifugat într-o centrifugă benchtop, și un stand perenestiproby DNK.Ustanovit termocycler și executați următoarea amplificarea ADN-ului de program: 1 ciclu: 94 ° C. C - 3 Min.- 36 ° C. C - 1,5 Min.- 72 ° C. C- 1,5 Min.- II.33 cicluri: 94 ° C. C - 0,3 Min.- 36 grade. C - 72 ° 1,5min.-. C - 1,5 Min.- III - 1 ciclu: 94 ° C. C - 0,3 min.-36 ° C. C - 1,5 Min.- 72 ° C. C - 10 min.Primechanie. Din cauza analizarekomenduem utilizarea largă chuvstvitelnostiRAPD numai un termocycler și tolkoodnim selectat set de reactivi pentru amplificarea ADN-ului. Vsereaktivy pentru amplificare și ADN preparate trebuie să fie depozitate camera vmorozilnoy la 20 ° C. C. reînghețare (sub -20 grad.C) prepararea unei termostabile rezultatelor ADN polimeraza în pierderea eeaktivnosti.Elektroforez electroforeza în gel de agaroză și vizualizare produktovamplifikatsiiDlya Prepararea 2 procente agaroză necesară pentru a adăuga 1 gagarozy tampon 0,5x TBE la 50 ml și se amestecă bine. Balonul a fost închis folgoy.Kolbu agaroza a pus într-un mini-autoclavă sau presiune aragaz iavtoklavirovat 15 min.Rasplavlennuyu agaroză este răcită la temperatura de 50 de grade. C și se toarnă vpodgotovlennuyu mucegai gel, evitând formarea de bule vgele. Grosimea Gel ar trebui să fie de 0,5 - 0,7 sm.Cherez 30 -. 40 de minute, când se formează gelul, elimina grebenkui se transferă către camera de electroforeză, predvaritelnozapolnennuyu tampon TBE 0,5x. Gelul trebuie să fie complet pokrytbuferom 1 - 2 mm.K 2 tampon de încărcare ul se adaugă 10 - 13 l reaktsionnoysmesi conținând ADN produși de amplificare peremeshatpipetirovaniem și aplicate cu atenție în godeurile unui gel de agaroză. La extreme marker molecular lunkunanesti massy.Primechanie. De obicei, marker massyispolzuyut ADN fagul lambda molecular tratat cu Hind enzimei de restricție III sau Pst I iEcoR I.Elektroforez efectuat la 50 V (5 V / cm) bromfenolovyysiny până când ajunge la nivelul de 1 cm de la marginea gelului. Tipic elektroforezdlitsya 3-3.5 chasa.Dlya Vizualizând amplificat fragmente ADN gelpomeschayut în soluție de bromură de etidiu (5 mg / ml) și provodyatokrashivanie timp de 20 min. pe kachalke.Primechanie. Cu o soluție de bromură de etidiu și a alerga în gelemneobhodimo colorate perchatkah.Chtoby reduce fondul de fluorescență cauzate bromistymetidiem, gelul se spală de două ori cu apă distilată pripostoyannom apă pokachivanii.Primechanie. spălarea prelungită a gelului poate conduce kischeznoveniyu zone slabe și spectre de eroziune datorate diffuzii.Gel amplasate pe filtru transiluminator și lumină UV vedere vprohodyaschem prin ecran protector și zaschitnyeochki speciale. Dacă este necesar RAPD oranzhevyyili spectre fotografiat printr-un filtru roșu pe tipul de film "Mikrat". DNA Fragmentyamplifitsirovannoy după tratamentul cu bromură de etidiu sub UV budutflyuorestsirovat tsvetom.Primery orange folosind analiza RAPD pentru identifikatsiigenotipov kartofelyaV hârtie 19 folosit primeri decamerice. ADN-ul Spektryamplifitsirovannoy cartof au avut mari lungimi diferite kolichestvofragmentov. RAPD clasele spectre Analiza kartofelyas folosind primer-19 Pta a relevat specii polimorfizmmezhdu semnificative (Fig. 1) *>. Datele obținute arată unele variabilitate osuschestvennoy soiuri intravariety starinnyhotechestvennyh. Utilizarea chislapraymerov limitate la diferite clase obținute RAPD spectre spetsifichnyedlya clasă separată. Analiza spectrelor permite diferențe ADN vyyavitneznachitelnye între clase strâns înrudite chiar těchto au fost produse ca variante somaclonale ale uneia și analiza de identificare a cazurilor BTEX ADN zheroditeley.Osnovannaya pot fi utilizate atunci când soiurile nu pot fi în mod fiabil distinge electroforeza proteinelor porezultatam, inclusiv vsehstadiyah analize pe parcursul dezvoltării plantelor. a dezvoltat o metodă rapidă pentru izolarea ADN-ului din glazkovkartofelya si tehnica RAPD pentru a ajuta la reducerea timpului și stoimostanaliza. Identificarea prin varietăți de analiză ADN pot fi sdelanamenee decât 24 ch.Kontrol modificări somatice în genomul și propagat invit0ro cartofi transformați pe aceiași primeri dokazalvysokuyu eficacitatea analizei ADN-ului în identificarea genotipovrasteny (Fig. 2) *>.-------------------------------- *> Desenele nu sunt privodyatsya.Zaklyuchenie. Izolarea micrometodă propusă a materialului izrastitelnogo ADN genomic pentru RAPD-analiza este un rapid, economic, deoarece nu necesită echipamente scumpe ireaktivov în comparație cu alte metode moleculare otsenkirastitelnyh genotipuri și, de asemenea, simplu de implementat. Rastitelnyymaterial pot fi luate ca de seră câmp și cultivate vlaboratornyh condiții. Acest lucru nu necesită micrometodă țesutul plantei bolshihkolichestv (1 - 20 mg), care este bolshimpreimuschestvom în comparație cu alte metode, deoarece planta pentru alte raboty.Perechislennyedostoinstva pozvolyaetsohranit această metodă face foarte convenabil atunci când se lucrează cu un număr mare de probe pentru analiza de masă și de asemenea priizuchenii genotipuri individuale rasteniy.5.2. Determinarea dacă DNKv transgenice produse finite pitaniyaStandartno opredeleniyanalichiyachuzherodnogo metode de material genetic și analiza produselor yavlyayutsyaimmunologichesky și identificarea ADN-ului transgenic la reacție în lanț pomoschipolimeraznoy (PCR) a acceptat. Acest studiu pischevyhproduktov, fabricat selskohozyaystvennoesyre de pornire supus unui tratament termic, poate da immunologicheskiyanaliz vosproizvodimyerezultaty instabil și slab ca proteinele denaturate sunt adesea nu sposobnyvstupat o reacție specifică cu anticorpi la belku.Polimerazno nativ - reacția în lanț în acest sens are tempreimuschestvom că tratamentul termic materii prime nu afectează ADN nakachestvo ca matriță și, prin urmare, conținute în produktahpitaniya și semifabricate max ADN rezidual de materie primă priprovedenii PCR dă aceleași rezultate ca și criteriu DNK.Vtorym nativ pentru a selecta PCR ca metodă de analiză a sensibilității yavlyaetsyavysokaya depășind cel puțin dvaporyadka metodov.Pomimo cunoscută sensibilitatea imunologică a PCR este mult mai puțin costisitoare și boleestabilnym metoda decât alte metode de analiză. Odnimnemalovazhnym Un alt avantaj al PCR este ca oligonucleotide sintetice utilizate vreaktsii dacă în mod corespunzător vyboremogut fi aplicate pentru analiza diferitelor transgene care, în cazul metodelor imunologice nevozmozhno.Metody determinarea dacă DNKv transgenice terminat produse alimentare prin intermediul polimeraznoytsepnoy ADN produktaV reaktsiiVydelenie este selectat din metoda de testare alocare ADN-ul rol decisiv igraetsoderzhanie ulei în produsele alimentare. Cu soderzhaniimasla crescut (ciocolata, ulei vegetal rafinat, etc.) extracție suplimentară suspensie nepolyarnyhrastvoriteley cu apă. Acest lucru face posibil transferul ADN-ului conținut produs vpischevom în faza apoasă, în care curățarea proizvoditsyadalneyshaya. Pentru tehnica de curățare finală ispolzuetsyaoriginalnaya dezvoltat la centrul "Bioinginerie"Convențional, lungimea fragmentului PCR în identificarea ADN neprevyshaet 1000 de perechi de baze transgenice, cu toate acestea nizhesleduyuschihmetodik au format baza pentru procedurile de izolare și purificare a ADN poluchitdostatochno Preparatele pure pentru PCR. Tehnicile de eșantionare Vtorymkriteriem a fost cerința de a minimiza timpul petrecut pe alocarea de un singur medicament DNK.Metodika1. 0,5 g din eșantionul alimentar este omogenizat cu un pistil de teflon sau pomoschisteklyannogo în 0,5 ml de tampon A (100 mMt0ris-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA, 500 mM NaCI, 10 mM beta-mercaptoetanol) .2. După omogenizare, 100 pl de SDS 20%. Smestschatelno amestecat și incubat timp de 20 - 30 min. la 65 de grade. C.3. Răcit la 4 ° C. C, se adaugă 0,3 ml de 5 M acetat de potasiu, agitată prin vortexare și centrifugate timp de 10 min. la 15000ob. / min. într-o microcentrifugă la temperature.4 camerei. La supernatant se adaugă 1 ml de rășină MaxiPreps Wizard (Promega, USA) și amestecul a fost incubat timp de 10 min. la 25 de grade. C.5. Apoi, amestecul rezultat este pompat prin mini kolonkuWizard (Promega, USA), se spală cu 2 ml de 80 la suta izopropanol, otzhimayutostavshiysyavmini-kolonkeizopropanoltsentrifugirovaniem într-o microcentrifugă (15.000 rot. / Min., 2 min.). 6. Microcoloană adăugat în 50 pl de apă distilată încălzită la 65 ° C. C.7. Incubeaza mini - o coloană de apă de 10 minute. la 65 de grade. C, iotzhimayut soluție ADN într-o centrifugare curat mikrotsentrifuzhnuyuprobirku steril într-o microcentrifugă (15.000 rpm / min timp de 2 min ...) În funcție de conținutul de ADN al unui anumit holding alimentar unitate polimerază. - 50mkl volum de reacție în lanț necesită la 2 la 20 ui derivatului de preparare DNK.Obraztsy a alimentelor cu ADN-ul a crescut conținutul de ulei peredvydeleniem pentru a fi supus cloroform ekstraktsiiemulsiey suplimentar vode.Dlya de 0,5 g de produs este smesi0,5 omogenizate ml tampon și a 0,5 ml de clorofilă jugul 20 și omogenizatul a fost incubat min.pri 56 grade. C. Apoi a fost răcit la 4 ° C. C și min tsentrifugiruyut10. la 15.000 rpm. / min. într-o microcentrifugă la sala de fază temperature.Vodnuyu a fost colectat și transferat într-un tub curat. Daleeprodolzhayut din etapa 2 metodiki.Vybor primeri pentru cele de mai sus PTsRDlya determină cu acuratețe prezența ADN-ului transgenice pentru a fi compania furnizoare furnizează informații molekulyarnoystrukture insert transgenic, și anume nukleotidnayaposledovatelnost acestuia. Această cerință este introdus pentru a identifica cu precizie canwas prezența geneticheskoykonstruktsii specifice. În acest caz, oligonucleotide sintetice vor fi sintetizate prin dlyaprovedeniya PCR, astfel încât prezența vyyavitfakt a transgenei regiunii de codificare. Lungimea prianalize primeri specifici folosiți trebuie să fie de cel puțin 25 parnukleotidov pentru a evita apariția ca urmare a produșilor de reacție PTsRnespetsificheskih caz în care nemozhet fi reprezentate astfel de informații pentru anumite motive (de exemplu, firma - puterea procesorului proizvoditelproduktov este singura organizație proizvodimogodrugoy materiei prime transgenice ) provoditproverku nevoie de prezența produselor secretate testate DNKnabora casete de expresie standard utilizat în m rovoypraktike pentru a produce plante transgenice. Celor otnosyatsyapraymery pentru a identifica gene marker de rezistență în mod selectiv (rezistenta la neomicina gena npt II și Higromicină MPI), atakzhe suprafețele utilizate de promotor în mod standard (E35S promotor virusatsvetnoy varză, etc.) .Vybor condiții de analiză PTsRDlya folosind primeri standard, în lume ispolzuyutobscheprinyatye condiții cazuri PTsR.Dlya de grunduire provedeniyaPTsR condiții specifice de selecție se efectuează pentru fiecare caz otdelno.Apparatura aplicabile în PCR Prezența Analiza eerezultatovAnaliz a transgenei insert de ADN conținută vproduktah de putere se realizează pe un termociclu ADN "Vp-4"fabricat "Biocom"Moscova. Calirea obraztsovosuschestvlyaetsya pe termostate uscate "Thermo 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Moscova. Pentru PCR Taq ispolzuetsyatermopolimeraza fabricat "Biocom"Moscova. Analizproduktov PCR a fost realizată folosind analiza de restricție etihproduktov prin electroforeză în gel de agaroză și modelul rezultat pe firma posleduyuschegofotografirovaniya transiluminator UVTIproizvodstva "Biocom"Moscova, pe film "Mikrat -Izopan" folosind camera foto "zenit" sau în format digital pripomoschi aparat de fotografiat digital "Kodak DC 120".Fotootpechatki sau imprimeuri realizate pe o imprimantă laser cu o rezoluție de cel puțin 600 de puncte pe inch, trebuie să fie atașat kprotokolu de ispytaniy.5.3. PCR blizkorodstvennyhshtammov Identificarea bakteriyV tehnicile actuale de biologie moleculară se bazează reacția în lanț a polimerazei naprimenenii (PCR) sunt toate boleeshirokoe utilizate în scopuri de diagnosticare si exprima - analizaraznoobraznogo material biologic. Metodele razvitiepodobnyh intensive datorită sensibilității foarte mare de PCR, posibilitatea rezultatelor rapide (în cadrul odnogorabochego zilei), costul redus al rezultatelor obținute (în comparație cu alte metode) și prelucrabilitate (grup de lucru curent vozmozhnostyuorganizatsii practic lyubyhusloviyah până expres mobil - laborator) .Alte metode biologice sau necesită dlyasvoey laboratoare realizatsiiorganizatsiispetsialnooborudovannyhdorogostoyaschih sau furnizează cut - molecular ultaty cu exemplul nizkoydostovernostyu.Tipichny imposibilității dostovernoyidentifikatsii - analiza filogenetică a speciilor strâns înrudite ponukleotidnoy secvenței 16SpPHK a genei. O astfel uzual analizyavlyaetsya pentru o descriere completă a vidovbaktery nou descoperite, dar oferă o fiabilitate scăzută a speciilor popytkerazlichit strâns legate, așa cum apare în tulpini industriale sluchaeidentifikatsii St0reptomyces izgruppy bacili sau bacterii de identificare B.anthracis.Metod folosind PTsRVybor metodaSredi bazate pe utilizarea PCR molecular - studii biologicheskihmetodov biodiversitatea cea mai potrivită pentru bacterii tseleyidentifikatsii este metoda de așa-numita DAF-PCR, dezvoltat de Caetano - Annoles (Caetan o - Annoles G, Bassam Ca J, Gresshoff PM (1991) ADN-amplificare amprentare folosind primeri oligonucleotidici veryshort arbit0rary Bio / Technology 9: 553 -556) .. În ceea ce privește alte metode, fie au nevoie de informații slishkomobshirnoy despre structura genomului unui anumit organism (detectarea directă a tulpinii - gene specifice), sau da nepolnuyudlya identificarea informațiilor specii strâns înrudite (RAPD-PCR, DALP-PCR), sau prea complexe și costisitoare și nu pot bytrekomendovany pentru utilizarea pe scară largă (AFLP-PCR) .Edinstvennym strangulare în DAF-PCR este selectarea adecvată dlyatochnoy identificarea scurtă oligonucleotidică praymerov.Vybor praymerovRazrabotannoe vtsentre "Bioinginerie" RAS programmnoeobespechenie pentru analiza secvenței nucleotidice bacterii polnyhgenomnyh permite o oligonukleotidnyhpraymerov alegere pentru DAF-PCR, oferă identifikatsiyubaktery încredere la nivelul tulpinii, care corespunde individualnymrazlichiyam la oameni și alte eucariote superioare. O astfel de rabotaprovedena pentru identificarea grupului bacteriene strâns legate. anthracis, pentru care identificarea folosind standartnyhmetodov (analiză filogenetică a posledovatelnostigena nucleotidice 16SpPHK) a fost bezuspeshnoy.Vybor condițiile de reacție PTsRUsloviya determina gradul de rezultate de precizie ivosproizvodimosti și trebuie să aibă loc pentru konkretnoygruppy bază de date electronică bakteriy.Sozdanie dannyhDlya identificarea completă și fiabilă specifice mikroorganizmaneobhodimo creează o bază de date electronică despre un anumit gruppebaktery, care include informații cu privire la maxim OMS mozhnomchisle diverse disponibile sub formă de culturi pure sau tulpini kollektsiitipovyh bakteriy.Vydelenie DNKNaibolee rezultate sigure în PCR randamentele un vydelennayaneposredstvenno ADN prin dirijarea reacției zamorozhennoybakterialnoy pastă folosind metoda rășină firma Promega (USA) de contact pomodifitsirovannomu și Birnoboyma Procent: - 20 - 40 pl de bacterian dezghețată masele 100mkl suspendate în tamponul de i (50 mM t0ris HCI, pH 8,0, 5 mM EDTA, 50 mkg / ml ARNază) se adaugă suspensie .K 120 pl de tampon de liză (NaOH 0,2 M, SDS 1%) și se așteaptă liza bacteriană ca visco ascendent văzut stisuspenzii. Ulterior, proteinele bacteriene și peretele oblomkovkletochnoy complex precipitat prin adăugarea a 100 pl de 2,55 M acetat de kaliyapri agitare viguroasă pe un vortex timp de 5 min. Zhestkoevstryahivanie turbionate necesara porvatdlinnuyu ADN-ului bacterian care, fiind atașat la punctele membranei vneskolkih, altfel se încadrează osadokvmeste cu complex SDS-proteine. Amestecul a fost apoi centrifugat namikrofuge timp de 5 - 10 min. Supernatantul a fost transferat într-o microcentrifugă pentru mlprobirku 1,5, conținând 0,75 ml de rășină "Wizard PCR-Prep"sau "Expertul Mini Prep" compania Promega. Amestecul a fost complet peremeshivayuti este pompat prin mini-coloană, rășina a fost spălată pe coloană vmini precipitat 2 ml de 80% izopropanol, centrifugat într-o microcentrifugă 1 min. la viteza maximă pentru a îndepărta iminikolonku rezidual lichid plasat într-un tub de 1,5 ml steril de microcentrifugă, aplicat în mică - o coloană de 50 l de apă bidistilată sterilă și ilideionizovannoy încălzită coloană tub 5 min. când 70grad. C. Apoi, mini - coloana din tubul este plasat într-o microcentrifugă timp de 1 minut itsentrifugiruyut. la viteza maximă pentru ADN-ul perenosarastvora într-un tub de testare. metodă descrisă, de ordinul a 5 mkgDNK. Mărimea ADN-ul rezultat - de la 3 la 15 kb, pentru a separa că vpolnedostatochno 16S RNAs de bacterii (aproximativ 1500 bp primer priispolzovanii pereche 11F / 1492R). soluții și ustensilele de ADN obținute ispolzovaniyasterilnyh furnizate pot fi depozitate la + 4 ° C. C, timp de șase luni. Perioada de valabilitate a preparatelor de ADN la 20 ° C. C este mai mare de 2 reactivi goda.Ispolzuemye și oborudovaniePTsR osuschestvlyaetsyanaDNKamplifikatorah"Vp-4"fabricat "Biocom"Moscova. Calirea obraztsovosuschestvlyaetsya pe termostate uscate "Thermo 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Moscova. Pentru PCR Taq ispolzuetsyatermopolimeraza fabricat "Biocom"Moscova. Analizproduktov PCR a fost realizată folosind analiza de restricție etihproduktov prin electroforeză în gel de agaroză și modelul rezultat pe firma posleduyuschegofotografirovaniya transiluminator UVT1proizvodstva "Biocom"Moscova, pe film "Mikrat -"Izopan" folosind camera foto "zenit" sau în format digital pripomoschi aparat de fotografiat digital "Kodak DC 120". Iliottiski printuri fotografice realizate cu o rezoluție a unei imprimante laser nu este dpi menee600, trebuie să fie aplicat protocolul provedeniyaispytany. oligonucleotidele primeri au fost sintetizați la Centrul"Bioinginerie" RAN.5.4. Metode de determinare a vstavki5.4.1 global svoystvgeneticheskoy. Izolarea ADN-ului genomic prin reacția în lanț a polimerazei și conduită. Pentru a izola ADN genomic dintr-o probă de fenol mozhetprimenyatsya produsului - cloroform sau o altă metodă adecvată [124]. Rezultate Preparatele de ADN sunt depozitate la minus 70 de grade. C iispolzuyutsya pentru analiza prin reacția în lanț a polimerazei (PND). oligonucleotidele primeri pentru PCR pot fi predostavlenyfirmoy - produse producător sau pot fi sintetizați în conformitate cu structura de date pozakazu vstavki.5.4.2. In efectuarea PCR folosind Taq ADN-polimerazaproizvodstva IBCh. In experimentele tipice polimerizatsionnuyusmes volum de 50 ul este construit astfel încât acesta conținea 350 ADN nggenomnoy, 1,5 mM fiecare dintre chetyrehdezoksiribonukleotidtrifosfatov (compania MBI Fermentas Lithuania), 1 unitate. Taq-polimerază. Apoi, la amestecul de polimerizare a adăugat 30pkM pereche de primeri de oligonucleotide în compoziție tampon rastvoresleduyuschego: tampon 67 mM Tris-HCI (pH 8,0 la 25 ° C), conținând 16,6 mM sulfat de amoniu, 67 mM MgCl2, 10 mm 2-mercaptoetanol, 6 , 7 mM EDTA, și albumină serică bovină vkontsentratsii 170 mcg / ml. Apoi, fiecare probă a fost stratificat pe ulei mineral 50mkl și reacția a fost efectuată în conformitate cu programe special adaptate pentru situs-specifică a genei ADN termocicluri vmnogokanalnom "Termtsik" producția SA"tehnologia ADN-ului" (Moscova) .Dacă este necesar, este posibil de a efectua PCR multiplex dlyaanaliza mai multe fragmente de amplificare au fost importante vstavki.Produkty analizate prin electroforeză vplastine 6 procente gel de poliacrilamidă (2,5 ore la 200 V) ADN-markeri este un set standard de fragmente de ADN obținute în conformitate cu plazmidypBR322 acțiunea enzimei de restricție Alu 1 (MBIFermentas firmă). Colorarea fragmentelor de ADN se efectuează cu bromură de etidiu. Analiza rezultatelor și fotografierea elektroforegrammyosuschestvlyayut în usloviyahultrafioletovoypodsvetkinatransillyuminatore.5.5. Metodele de evaluare vstavki5.5.1 operare. Determinarea ARNm produs prin inserția, în kotorayavvedena genomul plantelor folosind nested PTsR.Vydelenie Preparate mRNA totale din probele de produktaguanidin - tiocianat - fenol - Metoda de cloroform [125] iprovedenie primeri PCR ulterior cuibărit cu declarate [126, 125]. Detectarea electroforeza în gel de ADNc vpoliakrilamidnom sintetizat prin colorare cu bromură de etidiu [126] .5.5.2. Bidimensionale electroforetice Analiza belkov.V raboteispolzuyutsyasleduyuschie reactivi: acrilamidă, metilen bisacrilamidă, agaroză, Tris, glicină, dodecil sulfat de sodiu, persulfat de amoniu, Triton X-100, ditiotrietol Amberlite MB-1,2-mercaptoetanol, albastru Coomassie strălucitor R-250, kumassibrilliantovy albastru G-250, Tween-20, 4-clor-l-naftol, bychiysyvorotochny albumina - firme "Serva" (Germania) - Tween 20 - firme"Merk" (Germania) amfoline pH 3 - 10, pH 5 - 7, pH 5 - 8, firme"LKB" (Suedia) .În kachestveraskhodnyhmaterialovprimenyayutsyatakzhe: Nitroceluloză - firme "Schleicher și Schull"extracte (Germania) .Belkovye vsehizuchayuschihsyabiologicheskihmaterialov preparat similar folosind obespecheniyamaksimalnoy solubiliza agenți soluție proteine ​​de liză (LR) svysokimsoderzhaniemdenaturiruyuschih - mercaptoetanol uree (ditiotrietola) și Triton X-100. LR - 9 soluție Mmocheviny care conține 5% 2-mercaptoetanol, 2% Triton X-100, 2% amfoline 3.5 - 10.When prigotovleniiLRsnachala uree dizolvată apă vdeionizovannoy și purificat în continuare prin adăugarea AmberlitMV-1. După 10 min. incubare Amberlit rastvorumocheviny separat și adăugat Triton X-100, ditiotrietol (sau 2-mercaptoetanol), amfoline pH 3 la - 10 la extragerea respectivei proteine ​​kontsentratsiy.Pri probe de țesut au fost fragmentați cu foarfecele ineskolko ori cu soluție salină rece. țesut Zatemizmelchennuyu a fost omogenizat într-un omogenizator de sticlă steflonovym HR pistil la un raport de 100 mg în 2 ml de țesut LR itsentrifugiruyut la 700 g timp de 10 min. Fracțiunea supernatant care conține proteinele solubilizate (extract) a fost utilizat dlyadalneyshey analiza proteinelor raboty.Dlya folosind electroforeza bidimensională poO`Farrellu - metoda, sochetayuschiyfraktsionirovaniebelkovizoelektrofokusirovaniem (pervoenapravlenie) -elektroforezom un gel în prezența SDS [128, 129] .Izoelektrofokusirovanie realizat în tuburi de sticlă dlinoy150 mm și un diametru interior de 3,5 mm. Tub vshtativ ajustat, găuri mai mici sigilate și amestecul zalivayutpolimerizatsionnoy de film Parafilm. Pentru a compila polimerizarea smesigotovyat următorii reactivi: 1.1. 30 la suta acrilamidă, 1,6% metilenbisakrilamid.1.2. 20% Triton X-100.1.3. 10 la suta ammoniya.1.4 persulfat. tampon Anod pentru focusare izoelectrică: 0,01 Mfosfornaya kislota.1.5. tampon pentru Catod cu focalizare izoelectrică: 0,02M NaOH.1.6. Soluție de protecție: soluție 4,5 M uree conținând 1% Triton X-100- 2,5% mercaptoetanol, 1% amfoline pH 3,5 - 10.1.7. tampon transferabil pentru gel primă direcție - belkovyybufer (.. A se vedea secțiunea 2.2) O soluție 1.1- 1.2- 1.7 1,6 stocat la 4 ° C. 2 Escrocii - 3 săptămâni. Alții folosesc svezheprigotovlennymi.Prigotovlenie 20 ml de polimerizare de amestec necesare tuburi dlyazapolneniya 12, realizate prin amestecarea a 12 g de uree, 6,75ml de apă distilată, 3 ml 1,1 ml 2,25 rastvoraTritona X-100 (20%). Acest amestec a fost tratat cu un schimb de ioni smoloyamberlit MB-1, a fost filtrat și a fost adăugat 225 pl amfolinovpH de 3.5 - 10 si 900 pl amfoline pH 5 - 7. Amestecul a fost degazat, înainte de a turna în aneposredstvenno tub la care sa adăugat 22,5 și 32,5 mklTEMED l de 10 procente amestec soluție PSA.Polimerizatsionnuyu a fost introdusă în tubul cu seringa, de jos în sus zapolnyayatrubki la același nivel de 2 - 3 cm sub verhnegokraya (gel înălțime coloană de 11 cm). Top închidere vodu.Posle polimerizare gel stratificat de apă peste tubul său poverhnostyuudalyayut și plasate în camera gelelektroforeticheskuyu"Bio-Rad"Modelul 175 (SUA). In camera inferioară nalivayutrastvor tamponul rezervor catod. Probele de tub analizat se aplică vobeme 50 - 150 ui (100 ug proteină). Variantefraktsionirovaniya aplicat volumul semi eșantion este crescut la 250 - 350mkl. De sus, marginile tubului sunt soluția 1,7 iverhnyuyu camera stratificată dispozitiv anodic de protecție este umplut la echilibru buferom.Izoelektrofokusirovanie prinapryazhenii realizat pornind de la 400 V la 200 V.ch, și apoi la napryazhenii1000 V la 5400 valoarea sumei V.ch sau (noapte mod) In 210 prinapryazhenii douăzeci de ore și apoi o oră 1000 zhesummarnogoznacheniya5400V.ch.Neravnovesnyyvariantizoelektrofokusirovaniya pentru a efectua la o tensiune cuprinsă între 400 V.ch SAR 200, și apoi la 1000V V.ch la un total znacheniya1000 - 2500 V.ch .po final izoel coloană de gel ktrofokusirovaniya B5 înmuiate tampon transferabile ml (soluție 1,7) 10 min. când komnatnoytemperature. Apoi, gelurile nu sunt destinate nemedlennogofraktsionirovaniya într-o a doua direcție ihranyat congelate rapid la -20 ° C. C la mai multe nedel.Dlya doua fracționare napravleniiispolzuyutmodifitsirovanny metoda Laemmli [130] în plăcile cu un gradient de PAAG7,5 - 25% în prezența SDS.Dlya acest scop, se prepară următoarele soluții, din care zatemsostavlyayut amestecul de polimerizare pentru a forma plăci PAGE: 2.1. 60 la suta de acrilamidă, 0,8 protsentnyymetilenbisakrilamid.2.2. Pentru tamponul de gel separator: M Tris-HCI 1 (pH 8,8) .2.3. Buffer-ul pentru gel de stivuire: 0,5 M Tris-HCI (pH 6,8) .2.4. 10 la suta natriya.2.5 dodecil. 10 la suta ammoniya.2.6 persulfat. Electrod tampon de electroforeză: 0,025 M Tris, glicină 0,192M, 0,1 procente SDS (pH 8,3) .2.7. gel de agaroza: soluție 1% agaroză cu albastru bromfenol dobavleniem0,125 2,6%. După gătit fiert rastvorneobhodimo timp de 5 min., Și înainte de kazhdymispolzovaniem gel trebuie rastopit.Rastvor 2,5 preparată imediat înainte de utilizare, iar restul a fost depozitat la 4 ° C. A doua direcție C.Fraktsionirovanie efectuate vplastinah dimensiune PAGE 160 x 160 x 1 mm cu acrilamida liniar gradientomkontsentratsii 7.5-25%, în dispozitivul pentru vertikalnogoelektroforeza. Plăci cu gel preparate în steklyannyhkassetah standardul. EXEMPLU utilizare care detaliaza etogooborudovaniya publicate anterior [131] Convențional, pentru formarea de plăci paralele 6 gel de concentrare sgradientom de acrilamidă (separare gel) 2 O soluție a fost preparată: lumina (concentrația AA 7,5%) și (concentrație% AA25) grele, 100 ml din fiecare . Structura completă a acestor soluții este dat vtablitse.TablitsaSOSTAVY separat și GELURI concentrat + ----- + ------------------------------- ----------- + --------------- + | Componente | separare gel | Concentrându || + -------- + ------- + || gel | 25% | 6,5% | | + ------------------------------- + -------- + ------- + --------------- + | IBA-AA 60-0.8% ml | 41,8 | 12.5 | 3,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 1 M t0rIS pH 8,8, ml | 36 | 36 | - | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 0,5 M t0rIS pH 6,8, ml | - | - | 12,7 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 10% SDS, ml | 1 | 1 | 0,5 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | H2O ml | 20.4 | 49,3 | 33,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | TEMED, l | 53 | 53 | 20 | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 10% PSA, l | 240 | 240 | 400 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + grele și ușoare soluții sunt amestecate folosind smesitelGradient fost model 395 ("Bio-Rad", USA) sau analogichnoeotechestvennoe echipamente, astfel încât să se obțină lineynyygradient concentrației de acrilamidă în casetele care postepennozapolnyayutsya folosind o pompă peristaltică. De obicei, umplut simultan plăci 6, care asigură o identichnostihizgotovleniyai poluchennyhrezultatov înaltă reproductibilitate. După completarea polimerizării smesnaslaivayut apei. Polimerizarea continuă timp de 30 - 40 min. Zatemvodu îndepărtat, suprafața gelului sunt șterși cu hârtie de filtru izalivayut soluție formare stivuire gel.Dlya preparare 50 ml dintr-o soluție de concentrare componente de amestec gelyaneobhodimo prezentate în tabelul prichemkatalizatory (TEMED și PSA) a fost adăugat în mod direct peredzalivkoy gel. Polimerizarea se poate realiza în 3-40 min.Udaliv apei pe suprafața de stivuire nakladyvayutgel gel primă direcție și gelul de agaroză topit turnat (soluție 2,7). De la marginea fiecărei plăci este formată "buzunar" Proteinele dlyananeseniya - markere. În termen de 5 min. gelzatverdevaet agaroza, asigurând contactul complet al plăcii de gel napravleniyas primul gel, și plasat într-un dispozitiv de casetă dlyaelektroforeza.Elektroforez este efectuată în modul următor: amperaj 30 mA per 200 Vmaksimalnaya putere tensiune plastinumaksimalnoe 50 Vt.Elektroforez terminat când marginea conducătoare a colorantului dohoditdo gel de separare inferioară finalizarea .Dupa de fracționare pentru plăcile nagelevyh detectare proteinelor folosind o colorare cu Coomassie R-250 și azot -kislym proteine ​​serebrom.Okrashivanie cu Coomassie R-250 n metoduFairbanks oestriasis prin [132] într-o soluție de acid acetic 10 la suta, 25 la suta izopropanol, 0,05 procente Coomassie R-250.Okrashivanie efectuat într-o baie de apă timp de 15 min. spălare sposleduyuschey nelegat colorant 10 protsentnoyuksusnoy kislotoy.Okrasku azot - argint se realizează în modificarea Blum acidă [133] folosind următorii reactivi: O soluție de hiposulfit de sodiu (Na2S2O3 x 5H2O) - 0,2 g / l soluție de azot - argint 200 Acid ml - 0,4 g de azot de argint -kislogo, 150 l de formol soluție de developare 200 ml: Na2CO3 - 8 g, 4 ml rastvoragiposulfita de sodiu, 100 pl formalina.Vse procese argintare atunci când sunt transportate într-un agitator și vplastikovyh containere. Gelul după colorare cu Coomassie R-250otmyvayut vopsea acid acetic 10 procente la svetlogofona. Apoi, de trei ori 20 min. incubate în Removal 25-protsentnomizopropanole Gel SDS, după care apa promyvayutdistillirovannoy (20 sec.). În plus, timp de 1 min. gelinkubiruyut în soluție hiposulfit și de două ori timp de 20 de secunde. otmyvayutv apă distilată. In etapa următoare, gelul este menținut vrastvore azot -. Sour argint 15 min, apoi de trei ori cu 20sec. se spală cu apă distilată etapa finală vodoy.Na de gel a fost plasat în soluție în curs de dezvoltare iokrashivanie oprită prin spălare cu apă, gel kogdana mai apar noi geluri pyatna.Fotografirovanie realizate într-o mare sensibilitate umedă naplenku stare (de exemplu, Mikrat 300). Geluri dlyahraneniya uscate. În acest scop, au fost deshidratate într-o soluție care conține 3% glicerol și etanol 50% timp de 30 min., Zatemplotno fixat între două straturi de celofan și se usucă la temperature.5.5.3 vnatyanutom ambiantă. Determinarea produsului de expresie inclus vstavkimetodom immunoblottinga.Dlya provedeniyaimmunoblottinganeobhodimoraspolagatsootvetstvuyuschimi anticorpii murini împotriva proteinei codificate prin operarea detecție vstavkoypolipeptida.Dlya a vstavkirekomenduetsya produsului utilizat conjugat imunoglobulină anti-șoarece"Sigma" la o diluție de 1: 1500 sau conjugat împotriva immunoglobulinovmyshi "Amersham" diluat 1: 600.Na Analiza primei etape efectuate electrotransferul proteinelor de la firma PAAGna filtru de nitroceluloză "Schleicher și Schull"(Germania), în conformitate cu metoda lui Towbin [135] folosind bufernogorastvora conținând 20 mM Tris, 0,192 M glicină, 20 protsentnyymetanol, 0,1% SDS (pH 8,3 - 8,4). Electromigration este realizată pentru verticală camera B electroblotting companie specială"BioRad" (USA) (sau alt echipament similar) Tensiunea privelichine de 15 - 16V și un curent de 120 - la 160 mA techenienochi (12 - 14 ore) .Dupa okonchaniyaelektroperenosa nitroceluloză filtrpromyvayut în trei modificări ale 0,01M PBS (sodiu - tampon fosfat, pH7 4) 5 pentru detectarea min.Dlya transferat într-un filtru cu membrană de proteine ​​în techenie5 - 10 min. incubate într-o soluție de colorant (0,25% Ponceau-c, acid acetic 40%, 15% metanol). pata de fundal spălate etapă finală 0,01MPBS.Na înainte de legarea monoklonalnyhantitel, filtrul a fost spălat în PBS 0,1 M, conținând 30% izopropanol (pentru a îndepărta SDS), 3 x 20 min., apoi de cinci ori în 0,01 M 0,01MPBS și PBS-0,05% tween-20. Sorbtsiyuantitel suprima posibil filtru non-specifice prin incubare într-o soluție de 1% BSA în 0,01MPBS timp de 1 oră la 37 ° C. C (sau peste noapte la 4 grad.C). Filtrul a fost spălat cu 0,01 M PBS de cinci ori, apoi 0,1 M PBS-0,05% Tween 20 de cinci ori. În cele din urmă, este ținută în anticorpul rastvoresootvetstvuyuschih de incubare în 0,1 M PBS (diluție selectată caz ​​vkazhdom). După incubare cu filtru Acm 0,1MPBS a fost spălat de 5 ori și de 5 ori 0,1 PBS-0,05% Tween-20 și incubate cu peroksidaznymkonyugatom împotriva Ig de șoarece G timp de 2 ore la temperatura de 37 ° C. C. După pyatikratnyhpromyvok PBS 0,1 M și 0,1 M tampon PBS-Tween-20 dlyaokrashivaniya pour filtru (12 mg de 4-clor-1-naftol au fost dizolvate în 4 ml de etanol, volumul este ajustat la 20 ml cu 0,1 M PBS și adăugat direct peredprimeneniem 12 pl de 30 la suta peroxid de hidrogen), până la o manifestare clară ivyderzhivayut zon.5.5.4 pătat. Otsenkabiologicheskiheffektov produsul (e) vstavki.5.5.4.1 funcționare. Semipreparative preparatele proteice alocarea poslefraktsionirovaniya de proteine ​​extracte bidimensională elektroforezom.Dlya polucheniyaotdelnyh purificată summarnyebelkovyeekstrakty proteină preparatovdvumernym fracționat prin electroforeză în condiții standard descrise mai sus. Apoi detektsiyubelkovyh fracțiunile se efectuează în condiții de potasiu rastvoromatsetata non-localizare 4M. Altele similare Fracțiunile au fost excizate din 20 - 40 și piesele colectate gelevyhplastin geluri înainte de izolare a fost depozitat la -20 ° C. Poate C.Nekotorye proteinele eluate prin difuziune. In etihsluchayah bucăți obținute de geluri care conțin o proteină cu același nume, se macină și se omogenizează în apă deionizată, apoi eluată chegobelok timp de 15 - 20 de minute. gelyavstryahivaniem omogenat pe un agitator magnetic. După centrifugare vtechenie 20 min. la 700 g, supernatantul a fost colectat și procedura sosadkom se repetă de două ori. Supernatantul combinat (obemokolo 50 ml) s-a liofilizat, precipitatul este redizolvat în 1 - 2 apă rece mldeionizovannoy și produc scutirea de izbytkadodetsilsulfata de sodiu. precipitat Otdelyayuttsentrifugirovaniem (15 min. La 3000 g), care obespechivaetponizhenie concentrația de SDS în supernatant la 0,25% [134]. Apoi otostatka sărurile și SDS eliminați dializă distillirovannoyvody timp de 12 ore la temperatura de 4 ° C. Proteinele poluchayutelektroelyutsiey.Elektroelyutsiyu C.Neelyuiruyuschiesya executate direct în unitatea de firmă "Bio-Rad" (USA) Echipament ilianalogichnom. La prima dializnoymembrany (furnizat împreună cu instrumentul) l inkubiryut vtechenie 30 min. în tamponul de electrod pentru electroforeză (rastvor2.6) la o temperatură de 60 de grade. C. Fragmentele fracție soderzhaschieiskomuyu gel plasată într-un tub conectat cu membrană sdializnoy sticlă și umplut cu tampon electrod dlyaelektroforeza. Tubul a fost montat în aparat, superior și turnat tampon de electroforeză nizhnyuyukameru, iprotsess electrozi conectați efectuat peste noapte la o constantă amperaj izrascheta 5 mA per tub și de limitare a tensiunii. Belokkontsentriruetsya într-un volum de aproximativ 400 pl tampon rastvorsobirayut aceasta, membrana a fost spălată, iar această soluție se adaugă porțiuni kosnovnoy. Soluția de proteină a fost dializată ulterior proteină prin metoda Bradford izmeryayutkontsentratsiyu și munca liofiliziruyut.V pentru a determina concentrația proteinei razlichnyhrastvorah folosind metoda Bradford [136]. bază metodalezhit colorant legare albastru Coomassie strălucitor G-250 sbelkom analizaotbirayut probe de rastvore.Dlya (diluate în sluchaeneobhodimosti) conținând 1 - 10 g proteină în 0,1 ml. La 25 mklobraztsa adăugat 25 l de soluție de colorant conținând 0,05% albastru briliant Coomassie G-250, 5% etanol, 10% ortofosfornoykisloty și absorbanța la 594 nm. concentrația de Belkaopredelyayut dintr-o curbă de calibrare construită pentru albumina serică rastvorabychego ("Serva".5.5.4.2). Testarea proprietăților biologice ale culturii celulare inserțiile produktafunktsionirovaniya cheloveka.Dlya verifica proprietățile biologice ale testului funktsionirovaniyavstavki produsului utilizat - sisteme bazate pe culturi de fibroblaste umane postnatalnyhdiploidnyh obținute așa cum este descris anterior [137] Celulele .Kultivirovanie se efectuează într-un mediu DMEM (fabricat de "PanEco", RF) suplimentat cu ser de 5% rogatogoskota mare și 5% ser sângele din cordonul ombilical uman (fabricat de "PanEco", Federația Rusă), folosind fie fiole de sticlă Carrel, sau plastikovyeodnorazovye saltele ferme "Costar" (Olanda) sau în firmă cu 96 lunochnyeplanshety "nunc" (Danemarca). Ca krasiteleyprimenyayut organic colorant vital, albastru de metilen [138] și krasitelGimza [139] (firmă "Merck"Germania) .Pe prima etapă este stabilită în dependență kolichestvomkletok între gaură și intensitatea colorării cu albastru de metilen, dlyachego celulele au fost însămânțate la diferite densități în 96 godeuri planshetyi cultivate timp de 1 zi la 37 ° C. C. Următoarea kletkiprizhiznenno colorate timp de 1 oră cu albastru de metilen, bine vkazhduyu adăugarea a 25 pl de soluție de colorant. Se colorează apoi kletkidvazhdy clătite cu apă și se usucă în aer. Material Izmerenieopticheskoy densitate gaura realizată pe electrophotometer"Efos 9305" (firmă "Efos", Rusia) la 594 nm. Rezultate opredeleniyaopticheskoy densitatea și cantitatea de însămânțat per godeu kletokobrabatyvayut de un program de calculator "SigmaPlot" calculator ilianalogichnyh programm.Pri studierea efectului operației de inserție a capacității naproliferativnuyu produs de fibroblaste umane la celule în creștere în plăci cu 96 de godeuri, au fost adăugate diferite kolichestvapreparata a proteinei și după 4 zile de cultură probyokrashivayut albastru de metilen așa cum este descris mai sus. mikroskopiruyut vseproby paralele (MBI-3 LOMO microscop adaptirovannyykakinvertirovanny folosind o duză specială) dlyaotsenki stare morfologice de suspensie celulară de colorare raznoyplotnosti creștere kletok.Pered Giemsa în mediu DMEM cu 10% ser fetal de vițel vobeme 200 l adăugați în godeuri de plăci cu 96 de godeuri. Astfel Numărul pervyyvertikalny de găuri este controlată, nu este de suspensie zapolnyayutkletochnoy. Plăcile au fost incubate într-o atmosferă de 5 gaz protsentnogouglekislogo la o temperatură de 37 de grade. C. După o kletkifiksiruyut zi adăugarea la fiecare godeu 50 pl holodnogosvezheprigotovlennogo 2,5 procente glutaraldehidă. Cherez30 minute. fixarea la 4 ° C. C a fost scos din dispozitivul de reținere godeurile, lunkidvazhdy se spală cu soluție rece Hank și Giemsa mklkrasitelya umple 100, legarea specifică a cromatinei diluat 1:50 înainte de utilizare. Kletkiinkubiruyut dye 3 ore la 37 ° C. Krasiteludalyayut C. Apoi, godeurile au fost spălate de două ori cu soluție Hanks, 100mkl umplut soluție (0,1 M NaH2PO4: C2H5OH - 1: 1), eluare iinkubiruyut la temperatura camerei timp de 15 minute. când nepreryvnomperemeshivanii. Măsurarea absorbției elua la rastvoraprovodyat fotometru "Efos 9305" la o lungime de undă de 620 nm.6. svoystvam6.1 tehnologică - Evaluarea produselor alimentare, poluchennoyiz surse de funcționale modificate genetic. Nevoia pentru orice porazdelu de cercetare 6 este determinată de un expert al gosudarstvennogouniversiteta Moscova Biotehnologie Aplicată al Ministerului Educației al generalului rus iprofessionalnogo Federatsii.6.2. Durata de viață a proteinei organizmaglavenstvuyuschuyu umane joaca un rol, asa se pare vazhnymprosledit, în cazul în care nu suferă nici o schimbare în modificările protsessegeneticheskoy ca mozhetprivesti de inginerie genetică pentru a modifica structura si functia de proteine, proteine ​​chastnostifermentov.Svoystva unic legat de structura sa. Osnovnymmetodomissledovaniyastrukturybelkayavlyaetsyametodrentgenostrukturnogoanaliza cristalele. Cu toate acestea, pentru majoritatea proteinelor utilizate în datele nutriționale pe lor strukturepo mai multe motive necunoscute. Pe de altă parte, este cunoscut de proteine ​​chtostruktura determină, de asemenea, proprietățile termodinamice, care, la rândul său afectează număr svoystva.Suschestvuet metodele lor funcționale de măsurare proprietăți termodinamice, printre care și o metodă preferată este calorimetriei. Etotmetod vă permite să măsoare dependența de temperatură a teploemkosti.Iz ​​obținută dependență se poate calcula dlyanativnoy capacității calorice și formele denaturate ale proteinei și entalpia proteină temperaturudenaturatsii. Parametrypozvolyayut termodinamic calculat defini hidrofobie integral și proteinele konformatsionnuyustabilnost [38 - 40]. Aceste caracteristici tesnosvyazany cu proprietăți funcționale principale [41 - 44] .Metod ion pereche faze vobraschennyh HPLC permite unității de identificare zamenyaminokislotnyh reziduurile din macromoleculele de proteine ​​și proteine ​​de studiu prisravnitelnom indispensabile [44] .În procesul de schimbare a genomului organismului în acesta nakaplivayutsyakomponenty, obespechivayuschieegoustoychivost la factorii vneshnimneblagopriyatnym - boli, insecte - dăunători un erbicid etc. În anumite concentrații, aceste komponentymogut fi periculoase pentru sănătatea umană, este utilizat în pischuprodukty produse folosind metode genetice inzhenerii.Poetomu în timpul prelucrării industriale a materiilor prime astfel de schimbări mogutpotrebovatsya tehnologiei existente, opasnyhdlyazdorovyakomponentov rezidual obespechivayuschieminimalnoe. Astfel de modificări în tehnologia pot afecta indicatorii nakachestvennyh (funcțional -tehnologicheskihsvoystvah) preparate proteice produse din această geneticheskimodifitsirovannogosyrya.Krome, predpolagaetsyatselenapravlennoe schimbă compoziția de aminoacizi a proteinelor extrase din produse alimentare modificate genetic (de exemplu, având echilibrată ACN), pentru a spori pischevoytsennosti lor. Aceasta va implica în mod inevitabil schimbări în proprietățile funcționale ale preparatelor comerciale proteice -technological iotrazitsya calitatea produselor alimentare, în care oniispolzuyutsya. Aceasta, la rândul său, poate duce la schimbări în procesele neobhodimostivneseniya folosind etipreparaty. Prin urmare, un control continuu (monitorizare) proprietățile preparatelor proteice obținute din materii prime alimentare atunci când geneticheskimodifitsirovannogo bezopasnomsoderzhanii cu siguranță componente dăunătoare proteină cheloveka.Mikro- și macro-molecule determină ryadnaibolee importante proprietăți funcționale ale proteinei, cum ar kakrastvorimost, capacitatea de a stabiliza emulsii si spume formează geluri păstrează grăsime și umiditate [9 - 13] proprietăţile funcționale .Aceste sunt direct legate de skharakteristikami produse finite alimentare. + ----------------------- + ------------------------- --------------- + | proprietăți funcționale | Efectul asupra caracteristicilor finit || | Produs | + ----------------------- + ----------------------- ----------------- + | pH-ul unei suspensii apoase | caracteristică proteină preparatov- || | Definește posibilitatea fundamentală || | Utilizarea medicamentului în proteine ​​|| | Un anumit tip de produs | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | Solubilitate | este folosit ca pokaza- primar || | De proteine ​​de calitate Spune-preparatov- || | Cauze proprietăți reologice || | Sisteme de alimentare, durabilă cu conținut de proteine ​​|| | Emulsiile Ness stabilizat cu Belgorod || | Com zhirouderzhivayuschuyu capacitatea belko- || | O Preparate | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + | proprietăți reologice | determina nivelul de administrare a medicamentului || dispersii apoase | un produs care furnizează || solicitate | Proprietățile reologice complexe ale finit || | Produsul afectează modurile de material || | Curente în proces | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | retenție a apei și | afectează nivelul de introducere a produsului || zhirouderzhivayuschaya | Preparate proteice oferind || capacitate | reducerea pierderilor în procesul || | Prelucrate (fierte și prăjite), uniformă || | Coerența produselor, o scădere în căsătorie || | Rezultatul separării de apă și grăsime, || | Produse de reducere a volumului | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | concentrație critică | determină nivelul de introducere a produsului || gel TION | Preparate proteice furnizarea || | Necesar complex structural - || mecanic | Proprietățile iCal ale produsului finit | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | Emulsie | determină nivelul de introducere a stabilității produsului || | Preparate proteice care furnizează || | Prepararea emulsiilor lipidice stabile, || | Previne separarea grăsimii în procesul de || | Prelucrarea | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + Momentan nu există proprietăți funcționale metodyopredeleniya standardizate și rezultatele măsurătorilor dolzhnynosit natura comparativă în ceea ce privește medicamentele ilikommercheskim produsele fabricate din nemodifitsirovannogopischevogo metode syrya.Osnovnye de determinare funcțională proprietăţile preparatovprivedeny în tabelul de mai jos. -------------------------- + + ---------------- -------- + ------------ + | Index | Metoda de determinare a | || Literar || sursa | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | 1 | 2 | 3 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | compoziţie de identificare | metode histologice | 51 || produse ||| + ----------------- --------- + ------------------------ + ------------ + | Solubilitatea | Spectrofotometru | 50 | + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | retenție a apei | metoda de centrifugare | 46 || capacitatea ||| + --------------- ----------- + ------------ + ------------------------ + | stabilitatea emulsiei | metoda centrifugare | 47 | + -------------------------- + ------------- ----------- + ------------ + | concentrație critică | metoda termotropic | 48 || gel | gel + --------- || ----------------- ------- + ------------------------ + ----- + | Zhirouderzhivayuschaya FPIC b- | metoda de centrifugare | 49 || Nosta ||| + -------------------------- + --------- --------------- + ------------ + | conformationala | microcalorimetria | 38-40 || stabilitatea ||| + ------ -------------------- + ------------------------ + ---- -------- + | Identificarea amino | metoda HPLC ion pereche | 45 || resturile ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | proprietăți termodinamice | metoda diferențială | 39 || | microcalorimeters scanare ||| | Calorimetrul || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | hidrofobie Integral | microcalorimetria | 40, 41, 42, || || 43 44 | + -------------------------- + ---------------- -------- + ------------ + | proprietăți reologice | Viscometry | 52 || dispersii apoase ||| + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | compoziţia de aminoacizi | HPLC | 45 | + -------------------------- + ------------ ------------ + ------------ + | proprietăți organoleptice | Qualimetry | 53 || grăsime: culoare, miros, transparență |||| ||| + + -------------------------- ----------------------- - + ------------ + | indicele de refracție | rEFRACTOMETRIE | 53 | + -------------------------- + ------------------------ + ------------ + | greutate grăsime | densitometrie, | 53 || | Gravimetrie || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | grăsimi vascozitatii | Viscometry | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | gras - compoziția de acid | GC | 53 | + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | număr de iod | volumetrie | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | Acid valoare | volumetrii | 53 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | numărul de saponificare | volumetriei | 53 | + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | temperatura de gelatinizare | Viscometry | 54 | | amidon ||| + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | dimensiunea de boabe de amidon | microscopie optică | 54 | + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | retenție a apei | Gravity | amidon 54 || capacitatea ||| + -------------------------- + ------- ----------------- + ------------ + | proprietăți reologice | Viscometry | 54 || dispersii apoase de amidon ||| + --- ----------------------- ------------------------ + + - ----------- + | Umflarea amidon | microscopie optică | 54 || ||| boabe + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | concentrație critică | metoda termotropic | 54 || gelificare amidon | || + -------------------------- de gelificare + -------------- ---------- + ------------ + | conținut de amiloză și | Spectrofotometru | 54 || amilopectina ||| + ----------- --------------- + ------------------------ + ------------ + 7. mă 
Distribuiți pe rețelele sociale: 

 
 
înrudit
 
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.
Drept medical: drept, documente, responsabilități, reguli, acte.